3D打印仿哈弗斯骨结构——仿生细胞再生

来源：增材之光

近日，中国科学院上海硅酸盐研究所吴成铁研究员与常江研究员带领的研究团队在3D打印仿哈弗斯骨结构生物陶瓷支架用于多细胞递送和骨组织再生方面取得新进展。该研究团队通过模拟骨的多级结构及多细胞组成，采用光固化3D打印技术制备出仿哈弗斯骨结构生物陶瓷支架，并负载骨髓间充质干细胞和内皮细胞，促进血管化骨的修复。该研究成果近日发表在Science子刊Science Advances杂志(Sci. Adv. 2020; 6 : eaaz6725)上，并申请专利一项。论文第一作者为上海硅酸盐所在读博士生张猛，指导教师为吴成铁研究员。

支架的制造是成功进行骨再生的核心，但这仍然是医学领域中仍然很困难，尽管已经进行了大量的研究项目，从使用纳米管的变化到控制抗生素释放、替代材料和涂层的结构。

正如作者所指出的那样，虽然生物打印是医学研究的一个领域，科学家已经取得了长足的进步，但仍然有许多原因导致障碍：
•层次结构的复杂性
•机械性能要求
•骨驻留细胞的多样性

然而，大多数再生发生在松质骨中，因此，研究人员在成功治疗患者时必须关注的重点：

松质骨是由板状或棒状结构组成的网状结构，厚度约为200毫米。据估计，80％的骨重塑过程发生在松质骨中。但是，骨骼再生不仅需要重建骨骼结构，还需要修复血管或神经等其他组织。

仿生结构正显示出作为“高性能骨组织工程生物材料”的巨大潜力，这使得研究团队将重点放在使用3D打印哈弗斯生物陶瓷结构上，该结构可以以“简单而通用的设计”模仿骨骼。

该团队将骨的哈弗斯管、福尔克曼管及松质骨三部分结构一体化打印，通过改变哈弗斯管数量、直径以及福尔克曼管数量实现了对结构的精细调控，同时也实现了对力学强度及孔隙率的调控，能够满足不同患者的个性化定制需求。该研究还模拟骨的多细胞组成，将具有成血管作用的内皮细胞负载于哈弗斯管，将具有成骨作用的骨髓间充质干细胞负载于松质骨结构，并将两种细胞共培养，实现了多细胞的负载与运输，显著促进了两种细胞的增殖以及各自成骨、成血管基因的表达。动物体内实验表明负载两种共培养细胞支架的体内成骨、成血管效果显著优于单培养细胞支架及无细胞支架，体现了这种多细胞递送系统的血管化骨修复能力。这种基于仿哈弗斯骨结构的多细胞递送系统还可以递送多种骨组织常驻细胞，由于哈弗斯管内有血管和神经并行穿过，该团队还将具有神经修复作用的雪旺细胞负载于哈弗斯管内，将骨髓间充质干细胞负载于松质骨结构，发现负载两种共培养细胞支架的成神经基因表达显著优于单培养细胞支架，体现了这种基于仿哈弗斯骨结构支架的多细胞递送系统的普适性特征，可模拟体内多细胞组织工程的再生微环境。

具有皮质骨和松质骨结构的哈弗斯骨模拟生物陶瓷支架的3D打印。皮质骨结构包含哈弗斯管和福尔克曼管。（A到E）光学显微镜图像显示出不同的直径（D）和由洋红色箭头（A）表示的哈弗斯管的数量（N）N = 8，D = 0.8 毫米；（B）N = 8，D = 1.2毫米；（C）N = 8，D = 1.6毫米；（D）N = 4，D = 1.6毫米; （E）N = 2，D = 1.6毫米。比例尺，1毫米。（A到E）微型计算机断层扫描（CT）图像显示连接支架内部的哈弗斯管的福尔克曼管（蓝色箭头）。比例尺，1毫米。（F至J）SEM图像显示了支架的微观结构。

研究人员表示：“相互连接的哈弗斯管是从松质骨结构中分离出来的，用于非接触式细胞共培养。此外，将支架的外围和底部密封起来，以便可以将支架用于固定接种的细胞。”

创建支架需要几种不同的技术，包括使用静电纺丝和双螺杆挤出，模块化组织工程和3D打印。该团队在DLP 3D打印方面取得了最大的成功，设计了一系列具有哈弗斯管，福尔克曼管和松质骨的结构。

用于HBMSC-HUVEC共培养系统的仿生骨仿生生物陶瓷支架在细胞增殖和血管生成分化方面的表现比单培养更好。（A到D）接种在松质骨结构上的HBMSC的CLSM图像（A）和接种在哈弗斯管上的HUVEC直径不同，（B）D = 1.6毫米，（C）D = 1.2毫米，（D）D = 0.8毫米。比例尺，100微米。（E到H）SEM图像，（E）接种在松质骨结构上的HBMSC和HUVEC接种在哈弗斯管上，直径分别为（F）1.6毫米，（G）1.2毫米和（H）0.8毫米。（I和J）培养1、3、7、14天后，接种在具有不同（I）直径和（J）哈弗斯支架上的HBMSC，HUVEC和共培养的HBMSC-HUVEC的增殖活性。n = 6个重复。（K和L）HBMSC，HUVEC，Co-HBMSC（HBMSC-HUVEC共培养中的HBMSC）和Co-HUVEC（HBMSC-HUVEC共培养中的HUVEC）的成骨（K）和血管生成（L）基因表达，持续3天。n = 3个重复。* P <0.05，** P <0.01，*** P <0.001，$ P <0.05，$$ P <0.01。

基于哈弗斯的模仿生物陶瓷支架的rBMSC-rSC共培养系统在细胞增殖和神经原性分化方面比单培养表现更好。（A到D）（A）rBMSC单培养组和rBMSC-rSC共培养组中rBMSC的CLSM图像，其中rBMSC与rSC的比率为（B）3：7，（C）5：5和（D） 7：3负载在支架的松质骨上。比例尺，50微米。（E到H）（E）rSC单培养组和rBMSC-rSC共培养组中rSC的CLSM图像，其中rBMSC与rSC的比率为（F）3：7，（G）5：5和（H） 7：3负载在哈弗斯管支架上。

“在这里，我们进一步建立了基于哈弗斯仿骨支架的rBMSC-rSC共培养系统，其中在松质骨结构中生长的rBMSC和在哈弗斯管中生长的rSC。我们的结果表明，与rSC单培养相比，rBMSC-rSC共培养系统表现出更好的增殖和NGF，BDNF，TrkA和S100的更高表达。发现骨髓间充质干细胞可以促进SC增殖，传统上被用于促进感觉系统的恢复。”研究团队表示。

考虑到哈弗斯仿骨支架的临床应用，仍有一些问题需要研究。首先，在共培养系统中应进一步考虑更多的骨驻留细胞，例如成骨细胞，破骨细胞和巨噬细胞。多细胞协同作用的机制尚不完全清楚。需要进一步的研究来确定共培养细胞对基于哈弗斯仿骨支架的共培养系统中新骨骼，血管和神经形成的个体影响。