改改交联策略！3D打印海藻酸钠生物墨水发了《Biofabrication》

来源： EngineeringForLife

生物打印是一种制造具有可控几何形状充满细胞体积结构的关键技术。不仅可以用来复制目标器官的结构，还可以用来形成形状，以便在体外模仿特定的理想特征。在适合用这种技术处理的各种材料中，海藻酸钠因其多功能性而被认为是目前最有前景的材料之一。到目前为止，最广泛打印海藻酸钠生物汇的策略是利用外部凝胶化作为主要过程，通过直接将水凝胶前体溶液挤压到交联浴中或在交联水凝胶中发生凝胶化。近日，来自意大利米兰理工大学的Paola Petrini教授团队进行了内部交联藻酸盐基生物墨水制备体外肝组织模型的相关研究。研究成果以“Internally crosslinked alginate-based bioinks for the fabrication of in vitro hepatic tissue models”为题于5月24日发表在《Biofabrication》上。

本文研究了Hep3Gel的打印优化和加工：一种内部交联的海藻酸盐和ECM为基础的生物墨水，用于生产大体积的肝脏组织模型。本文采取了一种非常规的策略，从再现肝脏组织几何形状和结构转向使用生物打印来制造能够促进高度氧合的结构，如肝脏组织情况一样。为此，通过采用计算方法对结构设计进行优化。然后通过不同先验和后验分析组合，研究和优化了生物墨水的可打印性。制作了14层结构，从而突出了利用内部凝胶化直接打印具有精细控制粘弹性能的自立结构的可能性。装有HepG2细胞的结构成功打印出来，并在静态条件下培养了12天，证实Hep3Gel支持中/长期培养的适宜性。

1. 3D生物打印增强氧扩散数值模拟

图1 通过结构氧扩散的数值模拟

进行3D生物打印增强氧扩散的数值模拟，评估以设计几何为特征的静态培养结构可以达到的氧合程度。将这些结果与通过静态培养结构获得的结果进行比较，结构的特点是整个结构具有零孔隙度水平。在这些模拟中，30分钟后达到平衡。过渡阶段（从0分钟到30分钟）的分析显示了两种几何形状之间的显著差异并强调采用大孔结构有利于构建体的氧合。相反，无孔支架的特点是氧合的梯度从外围到中心不断下降。从数量上看，一旦达到平衡，大孔的几何形状比无孔的几何结构的氧合度高3-4倍。在30分钟内成功建立了均匀的氧合度，构建体中的O值与新鲜培养基中的O值相同，验证了设计的几何形状。有鉴于此，打印的工程生物汇将围绕这一特定形状进行优化。

2. Hep3Gel粘弹性能和微观结构随时间变化

图2 Hep3Gel和对照材料的粘弹性能及微观结构随时间变化情况

Hep3Gel和控制材料的随时间变化的粘弹性能以下列方式进行分测量的，保守模量（G）和损失模量（G"）是在水凝胶交联过程中进行。扫频试验的结果表明在所检查的时间点上，Hep3Gel、GEL和ALG样品已经越过了凝胶点，它们的保守模量G大于它们的损失模量G"。也可以观察到粘弹性能的变化，G'随着时间的推移而增加而损失模量G"几乎没有变化。在每个被检查的样品中逐渐减少也突出了这种特性。通过应用广义麦克斯韦模型得到的数据清楚表明，网目尺寸(即两个相邻交联点之间的平均距离）随着时间的推移而减少。这一趋势在GEL和ALG样品中几乎不明显，但在Hep3Gel中则明显得多。

3. 打印参数的优化

图3 通过流变学分析对可打印性能进行评估

Hep3Gel、GEL和ALG的粘弹性能总体趋势是一致的。GEL和ALG有着极其相似的交联动力学。在交联开始后约1小时达到凝胶点。在不同的是，在Hep3Gel的情况下，凝胶化的进展延迟，从"溶胶"到"凝胶相"的过渡是在从反应开始大约2小时后达到。此外，在24℃和37℃下，G'和G"的测量结果没有明显差异。表明了在所考虑的温度范围内，水凝胶的粘弹性行为是独立于温度的，在生产GEL所采用的浓度下，明胶对交联网的结构没有贡献。一般的次级相互作用会受到受温度变化的影响。所有水凝胶的粘弹性能与温度无关。剪应力振幅扫描（屈服测试）的数据表明在每个时间点，对于所有的材料，都有一个确定的剪切应力振幅，在这个振幅上，G"开始超过G'。表明在这种应力下，材料开始表现得像流体而不是固体。另一方面，恢复试验表明，在每个检查的时间点、Hep3Gel和对照材料都能或多或少地逐步恢复其原有的粘弹性能。

4. 打印参数优化与交联动力学关系

图4 用22G圆柱形针进行的可打印性分析

最小挤出压力，定义为沸点的长丝可以连续挤出的最小压力，Hep3Gel和对照材料都有类似的随时间变化的趋势。然而，虽然GEL和ALG显示出相似的数值，开始交联后，Hep3Gel在早期阶段的最低挤出压力较低、并逐渐变得与对照组的压力更相似。形状保真度结果的多参数分析表明，对于所研究的应用，可打印性系数P逐渐接近对照组。从交联开始的24小时后，与单位值的差异达到最小。并且可打印性的值和孔隙系数之间有定性的联系。基于这些结果，打印所检查尖头的最佳时间点是从交联开始的24小时。有可能为每种材料确定最有效的喷头速度和挤压压力组合。无论是圆柱形还是锥形配置。使用22G针头打印时获得的数据显示圆柱形和锥形针在最小挤出压力方面的一致差异。

5. 通过外部凝胶化使打印出的构建体稳定

图5 打印后流变性能和后处理流程

接着进行流变分析以了解挤压过程是否以及如何损害尖头的粘弹性能。在打印之后，所有材料粘弹性能最多下降25%。尽管如此，弹性模量G'仍然高于粘性模量G"，表明材料在挤压过程中受到的冲击并没有导致它们从凝胶阶段过渡到溶胶阶段。此外，在这个时间点上，打印出来的构建体很脆弱，不可能在不损坏的情况下处理。构建体制造45分钟后进行的测试表明，原始的流变特性得到了恢复、从而重申了Hep3Gel和对照组水凝胶的自我修复行为。在这个时间点，打印的构建体可以更容易处理，而不会断裂。然而，由于这种延迟可能会影响嵌入细胞的存活。通过研究不同浓度CaCI2溶液的影响，目的是为了弥补这种在粘弹性能方面的暂时差距。在不同浓度的CaCI2中，发现0.1%的CaCI2和0.5%的CaCI2都可以使用。这个过程并没有导致打印结构收缩，其形状在培养条件下保持稳定达12天之久，与形状和孔隙度的尺寸没有明显的差异。

6. 装有HepG2细胞生物打印构建体静态培养状态

图6 HepG2细胞生物活性状态分析

用Hep3Gel制作的构建体，定量分析发现有活力的细胞显著增加。从第6天开始，细胞开始持续增长，在第12天超过200%的存活率。这一趋势在对照材料中没有发现，细胞活力在整个实验过程中基本保持不变。在Hep3Gel的情况下，从最初时间点到最后的时间点都可以观察到绿色荧光强度的增加。对照材料则没有观察到这种增加。无论是在Hep3Gel还是在控制材料中，红色荧光强度均没有增加。

7. 总结与展望

内部凝胶化是一种优异的方法，可以克服两个基于挤压海藻酸盐生物打印的主要问题。首先，打印出来的支架最终粘弹性能是完全可控的，并且可以进行微调。也避免了不希望和不可控的交联梯度形成。此外，这种方法还可以制造自立结构、不需要将海藻酸盐与其他材料混合，以提高结构的完整性。本文提出了一种直接的方法来优化这种类型的生物墨水打印能力。证明Hep3Gel和控制材料不适合于反应性生物打印。所提出的方法适合于优化打印参数，以制造所设计的构造。可允许打印14层自立结构，并且保持预先确定的粘弹性能。采用大孔3D生物打印的几何形状导致更高和均匀的氧合水平、甚至在构建体的核心区域。与在均匀水凝胶上进行的研究相比，这使得我们的培养时间延长了50%。进一步的研究应该集中在采用这个过程制造和培养构建物，嵌入更多的代谢相关细胞类型对本文提出的模型进行验证。

文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd872