清华大学欧阳礼亮：突破生物3D打印的流变学与力学边界

来源：EngineeringForLife  

生物3D打印以活细胞为原材料之一直接进行有生命的组织模型的构建，长久以来，它都面临着物理学与生物学之间的平衡。这一挑战和矛盾很早就被研究者重视，并衍生出“生物制造窗口”（Biofabrication window）的概念，它指的是上述挑战和矛盾往往导致材料特性被妥协在中等数值范围内，限制了生物3D打印技术的应用。近年来生物3D打印技术及生物墨水材料快速发展，大大拓展这个窗口，在生物3D打印系统中实现了很多非常规流变学及力学特性。然而，当前“生物制造窗口”概念较为笼统，无法完整和准确地描述生物3D打印全过程的物理学-生物学之间的复杂矛盾。

近日，清华大学欧阳礼亮（https://llouyang.com/）在Trends in Biotechnology（IF=19.536） 发表了题为“Pushing the rheological and mechanical boundaries of extrusion-based 3D bioprinting”的综述文章，提出了挤出式生物3d打印两个具体的“生物打印窗口“（Bioprinting window）概念，分别针对：1）打印过程中生物墨水的流变学特性；2）后续培养过程中打印结构的力学特性，在时空维度上较全面地描述了生物打印所面临基本技术挑战和难题。基于此，系统总结了近年来在拓展两个窗口边界方向上的典型研究工作，并展望了生物3D打印新的前沿边界。

图1 两个生物打印窗口：打印过程-生物墨水的流变学；培养过程-打印结构的力学

一、生物墨水流变学边界拓展
1. 生物打印窗口（矛盾点）之一：生物墨水流变学性能
一般认为，生物墨水需要有较高的粘度以保证挤出时的形态保持，实现三维成形，然而高粘度的墨水材料容易导致较大的细胞剪切损伤，影响细胞存活性。

2. 打印液相（无粘性）生物墨水
总结了三类典型的可实现非粘性生物墨水打印的技术策略，分别是原位交联、后交联以及悬浮打印。其中原位交联能实现一系列低于15 mps的生物墨水的直接成形，而不需要增粘剂；后交联也能实现储存模量在1 Pa量级的生物墨水的打印，但依赖于墨水材料的快速交联特性；悬浮打印依靠天然的悬浮介质作为支撑，也是实现低粘性墨水成形的有效手段。

3. 打印固相生物墨水
生物墨水流变学的另一个极端是固相墨水。已有研究采用预交联策略，对墨水预先交联以期保护细胞同时防止细胞沉降，但对预交联的程度较为敏感，可控性较差；近年来发展的微凝胶生物墨水，通过预先制备颗粒状载细胞凝胶微球，可以整体展现姣好打印性，同时不依赖原始墨水组分的交联特性；还有研究采用丝状微凝胶组成生物墨水，除了提供打印性，还能定向排列及诱导细胞。

图2 突破生物3D打印生物墨水的流变学边界：A-典型的打印液相（或非粘性）生物墨水的策略；B-典型的打印固相生物墨水的策略

二、打印结构力学边界拓展
1. 生物打印窗口（矛盾点）之二：打印结构的力学性能
为了保持结构保真度以及支持后续的稳定培养，打印的结构需要有一定的力学强度（打印的水凝胶材料杨氏模量一般在10 kPa及以上量级），然而，对于很多软组织（大脑组织杨氏模量在1 kPa量级）来源细胞而言，过硬的外基质材料会限制其生长及功能表达。

2. 打印超软载细胞水凝胶三维结构
载细胞超软三维结构的打印一直是一个难点问题，目前研究的总体思路是采用不同尺度的牺牲相。结构支持性牺牲法采用宏观的支持材料或结构，对软质结构起到临时支撑作用，比如采用无孔三维打印策略以及悬浮打印策略。不互溶牺牲法利用微米级不互溶相对基质材料起到临时支撑作用，比如双水相乳液法以及牺牲性微凝胶模板法。互溶牺牲法利用可互溶的组分临时提供结构支撑，是一种纳米分子尺度的牺牲法，常用的牺牲性分子包括明胶和海藻酸钠。

3. 打印超硬载细胞水凝胶三维结构
高力学强度结构的打印对于骨、软骨等组织的构建也极为重要。已有的在打印水凝胶中进行力学增强的策略包括支架法、复合材料法、多交联网络法等。支架法通过同步打印力学增强的亚毫米、微米高分子支架结构和载细胞水凝胶结构，通过软硬结合，实现整理的力学增强。复合材料法通过在水凝胶中复合纳米纤维、颗粒，实现力学增强，而多交联网络法的典型代表是双网络水凝胶。不同的策略虽然实现了打印结构整理的力学增强，但并没有改变所载细胞对直接接触的材料微环境的要求，实际中，直接装载细胞的材料相力学强度依然较低。

图3 突破生物3D打印生物墨水的力学边界：A-典型的打印超软三维结构的策略，B-典型的打印超强力学性能三维结构的策略

三、展望新的流变学及力学边界
1. 纯细胞生物墨水
一般而言，生物墨水流变学研究都是围绕水凝胶材料展开，然而生物材料并不是生物墨水的必须组分，这就衍生出一个新的生物墨水边界：纯细胞或高细胞浓度的生物墨水。这类生物墨水对于模拟组织级别细胞密度具有重要意义，目前已有研究直接采用纯细胞悬液或微球作为生物墨水进行组织构建，并展现巨大潜力。

2. 动态力学性能生物打印结构
材料力学性能对细胞的影响更多的描述的是静态性能，根据打印结构中细胞组织的生长需求，亟需响应性基质材料，能够适应组织发生发展的动态过程。动态力学性水凝胶及生物墨水近年来也得到了极大关注，有望助力生物打印组织结构从“形似”到“神似”的转变。

文章来源：
L. Ouyang*, Pushing the Rheological and Mechanical Boundaries of Extrusion-based 3D Bioprinting. Trends in Biotechnology (2022). https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2022.01.001