3D生物打印新突破！用于软组织缺损的患者特异性大体积支架成为可能！

来源： EFL生物3D打印与生物制造

外伤、肿瘤切除和其他外科手术可造成皮肤、脂肪、肌肉和其他结缔组织的大面积软组织损伤，由于损伤面积太大往往无法自行愈合，导致疤痕形成和功能缺损。其中，高达53%的战场创伤涉及四肢软组织，每年与肌肉损伤相关的创伤和肿瘤切除重建手术高达数百万例。自体组织移植通常伴有供体部位病变、功能丧失和移植失败风险。此外，在严重创伤中，找到合适的供体也具有一定的难度。再生医学通过增强人体自身修复能力，为大体积软组织损伤（VML）提供了一个新的突破口。脱细胞的细胞外基质（dECM）作为一种支持巨噬细胞和祖细胞浸润的支架材料，包含生长因子、细胞外囊泡和其他驱动骨骼肌生长、血管化和神经再生的促再生生物分子，有望用于VML。然而，目前制备这些dECM支架的方法局限于粉末、薄片和弱水凝胶。对于复杂和较大的损伤，这些技术都不足以完全填充伤口体积或提供一个工程环境来指导再生过程。新兴的3D生物打印技术有望获取更复杂、更大的3D支架，用于大型动物临床前模型，最终实现人类患者的治疗。

鉴于此，来自卡耐基梅隆大学的Adam W. Feinberg教授团队利用计算机断层扫描(CT)、磁共振成像（MRI）等临床成像数据和3D生物打印技术相结合，创造性地开发了解剖学上精确的支架材料（悬浮水凝胶FRESH）。作者将大体积、患者特异性的dECM贴片（~12 × 8 × 2 cm）植入大体积肌肉损伤模型中。分析表明，这些dECM贴片在尺寸上是精确的，并且能适应复杂创伤的表面。最后，作者将该方法扩展到人的大体积肌肉损伤应用中，以演示临床相关的具有纤维阵列和微结构的dECM支架的制备工艺。该研究成果具有显著的突破性，可用于临床转化和由于外伤、肿瘤切除和其他外科手术导致的软组织缺损患者的特异性治疗。文章以题为“3D Bioprinted Patient-Specific Extracellular Matrix Scaffolds for Soft Tissue Defects”于2022.9.5发表在《Advanced Healthcare Materials》期刊上。

1. 用于软组织缺损的患者特异性dECM贴片的制备
作者开发了一种患者特异性dECM贴片的制备工艺。即将VML损伤的CT/MRI成像、3D图像分割和嵌入式3D生物打印相结合，制备出可植入创面的患者特异性dECM支架（图1）。制备工艺涉及6个关键步骤，具体包括（i）图像处理：将组织缺陷的CT/MRI图像转换为患者特异性支架的可打印CAD模型；（ii）创制高浓度的dECM生物墨水，用于高保真的FRESH 3D打印；（iii）调整生物打印机，使用较大的25毫升注射器来制备大体积支架；（iv）将dECM支架转移到伤口部位；（v）通过定量分析法评估支架材料的保真度和共形性；（vi）通过控制dECM的密度和纤维排列，使该过程适应于人的VML损伤。

图1 制备患者特异性dECM水凝胶贴片的示意图

首先，作者在狗的股二头肌上形成一个长10厘米，宽7厘米，深约2-3厘米尺寸的伤口（图2），该伤口面足够大，可在愈合过程中产生实质性瘢痕。接着，进行了伤口CT扫描、体积分割、提取伤口的实体模型，然后将其挖空，形成一个壁厚为4毫米的外壳，并在伤口床周围清洗以隔离贴片。值得一提的是，与商业生物打印机（最大的10毫升注射器）相比，该打印机可匹配25毫升注射器，挤出生物墨水体积可高达26.5毫升，具有显著的体积优势。接下来，使用生物墨水对贴片进行FRESH 3D打印，该体系中生物墨水由35 mg/mL纯的I型胶原和20 mg/mL来自膀胱基质（UBM）的dECM按照1:1混合而成。

图2 FRESH 3D打印dECM贴片

2. dECM贴片的尺寸分析
dECM贴片的目的是匹配VML伤口的拓扑结构，并维持原有的形态，使得dECM与组织二者相匹配。为了评估这一点，作者在狗的肢体尸检后上创建了一个VML伤口，CT成像后，冻结肢体以保持结构的完整性（图3）。作者在生物墨水中加入2%的硫酸钡作为x射线造影剂。研究显示，FRESH打印的dECM贴片与原CAD模型相比，平均偏差为±1.55 mm，说明打印出的贴片具有总长度和宽度变化为1-2%的高保真性。对比植入前后的dECM贴片，平均偏差为±1.14 mm，表明植入过程中贴片相对于总长度和总宽度的形变程度不超过1.5%。植入的dECM贴片与原始CAD模型的平均偏差为±1.38 mm，说明初始的CAD设计与最终植入的贴片形态具有高度相似性。

图3 设计的dECM贴片与FRESH打印的dECM贴片进行植入前后的尺寸分析

为进一步确定患者特有的几何形状是实现合适覆盖的必要条件，作者从dECM生物墨水中打印出一块足以覆盖整个伤口的薄片作为对照。dECM患者特异性贴片和dECM薄片植入同一冷冻创口，通过CT成像记录接触面积和空洞的体积，从而评估支架的共形性。研究发现，打印的患者特异性dECM贴片的变形量可以适应伤口几何形状的微小变化，并实现轮廓匹配。此外，在dECM患者特异性斑块上可检测到87个空洞，虽然在植入的薄片上只检测到41个空洞，但总空洞体积比患者特异性贴片的总空洞体积大约4.8倍。且dECM患者特异性贴片接触创面的表面积为99.9%，与创面几何形状吻合度非常高，相比之下，薄片接触创面的表面积仅为90.3%。（图4）

图4 植入的dECM患者特异性贴片与薄片的共形性分析与空洞量化结果图

3. 在人股四头肌中制备一种针对VML的患者的特异性dECM贴片

作者采用了狗VML损伤工艺，并将其应用于临床相关的人类VML损伤，以证明利用CT数据设计基于未受伤对侧腿的患者特异性dECM支架的能力。首先，利用CT数据生成受伤和未受伤腿的3D模型。然后对模型进行裁剪，通过比对未受伤和受伤肌肉之间的差异，得到dECM支架的几何形状。接着，以硫酸钡为造影剂，用I型胶原蛋白和dECM生物墨水对dECM支架进行FRESH 3D打印、CT成像。最后，将原CAD模型与FRESH 3D打印支架进行外表面测量分析，结果显示，该工艺得到的患者的特异性dECM贴片具有良好的尺寸精度，其平均偏差为±1.47 mm，与狗VML实验中使用的dECM贴片的平均偏差相当。（图5）

图5 患者特异性dECM支架植入人的VML

总而言之，这项工作旨在以临床影像数据作为切入点，创建大体积dECM支架，涵盖VML损伤、支架植入以及适应人VML损伤的过程。未来的研究将做进一步的突破，即在此基础上设计具有确定微观结构、dECM组织来源、蛋白成份和力学性能的组织贴片，探究支架材料如何影响组织再生过程和功能特性。

文章来源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202200866