高分辨率投影式生物3D打印

来源： EngineeringForLife

投影式3D打印（PBP）的核心在于利用空间光调制器生成动态掩模，并将光学图案投影至光敏材料表面，实现选择性地精准固化。该技术在所有3D打印技术中具有最高的分辨率/制造时间比（RTM）。然而，在使用生物墨水作为打印材料的投影式生物3D打印（PBBP）中，打印分辨率却不尽如人意，实际的打印分辨率与理论分辨率之间存在显著差距。这主要因为活细胞的引入使得传统制造策略不再适用，对生物相容性的严格要求大大限制了打印分辨率。

EFL团队致力于生物3D打印研究十余年，为全球5000多个实验室提供生物3D打印系统解决方案，涵盖光固化生物墨水和投影式生物3D打印机。在与众多同行科学家交流的过程中，我们发现背景知识的差异导致了对许多基本概念的误解和混淆。例如：“光学分辨率”被误认为是“打印分辨率”；许多声称“高分辨率生物打印”的研究工作却展现出几个数量级的差异；“生物墨水（Bioinks）”的打印分辨率被混同于“生物材料墨水（Biomaterial inks）”的打印分辨率，诸如此类。

由于缺乏公认的分辨率定义，在描述新方法时常会出现混乱，无疑阻碍了该领域的发展。因此，我们认为有必要澄清高分辨率PBBP的一些基本概念，以帮助来自不同背景的科学家深入理解其核心逻辑。为此，我们系统总结了实现高分辨率PBBP的必要步骤和挑战，并为每个技术环节梳理了可行的优化策略。同时，我们也分享了一些对未来发展趋势的看法。我们希望为科研人员提供核心知识支撑，共同推动PBBP技术在组织工程与再生医学领域的迅速发展。相关工作“High-resolution projection-based 3D bioprinting”发表于《Nature Reviews Bioengineering》。浙江大学机械工程学院博士生何超凡为第一作者，贺永教授为通讯作者。   

投影式生物3D打印的“分辨率”：市面上的投影式3D打印机均会标注一个标称分辨率数值（通常为2-50 μm）。此分辨率通常指的是光学分辨率，即理论上可达到的最高分辨率，定义为“投影图案中单个像素点的尺寸”，具体由DMD微镜的尺寸与投影镜头的放大倍率共同决定。然而，在实际应用中，我们更为关注的是打印结构的实际分辨率，即打印分辨率，定义为“打印结构中可区分的最小尺寸”。它不仅受打印机光学分辨率的影响，还受到打印材料光响应特性的制约。因此，即便是同一台打印机，其打印分辨率也可能存在较大差异。光学分辨率具有明确的定义和测试方法，而“可辨识的”最小尺寸则是一个相对模糊的概念。因此，测试打印分辨率的方法也不尽相同。总体而言可分为四类：正分辨率（RP）、负分辨率（RN）、水平分辨率（RXY）以及垂直分辨率（RZ）。尽管它们都被统称为“打印分辨率”，但实际上各自具有不同的含义和适用场景。

图1 投影式3D打印的分辨率

“高分辨率”生物3D打印：高分辨率是一个相对且动态的概念，它会随着技术的不断进步而发生变化。然而，确立一个客观的物理指标作为衡量标准是非常必要的。在生物3D打印领域，可以通过分析理论上可达到的最高打印分辨率，并在此基础上进行适当放宽（通常是理论极限的五到十倍），从而设定一个高分辨率的标准。考虑到准确且合理的定义对于避免歧义、确保研究的准确性和可重复性至关重要。这里我们定义：对于使用含有活细胞的生物墨水，打印分辨率达到50 μm被定义为高分辨率打印。而对于生物材料墨水（即打印材料作为后续细胞接种的支架），打印分辨率达到10 μm被定义为高分辨率打印。这也与当前许多研究保持一致。   

高分辨率投影式生物3D打印策略：

使用树脂的传统PBP的打印分辨率与光学分辨率可以非常接近（打印分辨率可达光学分辨率的2-3倍），然而使用生物墨水/生物材料墨水的PBBP的打印分辨率却远低于理论值（打印分辨率通常为十几倍的光学分辨率）。因此，生物3D打印需要进行全面的系统优化，而非仅仅局限于对某一单个步骤的改进。为了推动高分辨率PBBP技术的发展，我们总结了实现这一目标所需的三大关键步骤，并通过构建优化路线图，为打印分辨率的提升提供全面指导。

构建精准光场
在PBP技术中，提高打印分辨率的一个核心在于构建可控的投影光场。这一过程的实现首先依赖于打印软件，将设计的3D模型精确地切割成一系列二维图像。随后，这些图像通过一个复杂的光学系统进行投影。该系统通常由光源、均匀透镜组、数字微镜设备（DMD）以及投影透镜组成。光源发出的光线首先经过均匀透镜组，然后照射到DMD上。DMD中的每个微镜根据预设的切片图像反射光线，经过投影透镜的缩放作用后，最终形成投影光场。值得注意的是，这一系列步骤中的每一个环节都会对光学分辨率产生直接影响。无论是PBBP还是PBP，其打印分辨率的上限都受到光学分辨率的制约。  

图2 构建精准光场

墨水精确响应

提高打印分辨率的第二步是确保生物墨水能够准确地响应光场。为此，在保持生物墨水生物性能的同时，改善其光响应特性显得尤为重要。理想的生物墨水应具备高的光交联速率、适当的交联密度以及良好的流动性。同时，为了确保生物相容性，生物墨水中的化学添加剂应尽可能少。因此，在生物（材料）墨水通常仅包含生物相容性材料、光引发剂、光吸收剂、生物活性成分以及可能的细胞组分。   

图3 墨水精准响应

维持力学平衡

实现高分辨率PBBP的最后一步在于保持打印过程中的力学平衡。这一步骤至关重要，因为生物墨水通常为超软材料（杨氏模量低于103 Pa）。由于生物墨水与传统材料之间存在显著的力学性能差异，因此，在打印过程中需要谨慎操作以保持机械平衡，否则很容易导致打印结构的断裂和变形，这是PBBP所独有的挑战。   

图4 维持力学平衡

贺永教授团队从事生物制造研究工作数十年，研究工作涵盖墨水成形理论、打印工艺、打印设备以及应用。近两年的代表性工作包括：
（1）揭示了光固化生物墨水的成形机理，定义了包括平均反应步数等生物墨水成形状态的四项精确评价指标（Advanced Functional Materials, 2023）,制定了光固化生物墨水GelMA的命名规范及标准（Advanced Healthcare Materials，2023），给出了高精度光固化生物打印所需遵循的准则（Nature Review Bioengineering, 2024）。与李文妍教授团队合作揭示了可控机械应力驱动细胞行为、诱导听觉神经中的感觉上皮形成机制（Science Advances, 2023）。

（2）提出了基于“生物混凝土”概念的原位3D打印方法，能够在灾难现场、战场等极端环境下实现快速打印及创伤修复（Nature Communications，2022）；面向微创手术下如何有效再生，提出了可收缩支架微创植入新方法，为软组织修复提供了新的解决方案（Nature Communications，2024），通过仿蓝环章鱼结构设计新型微针，实现了潮湿环境下药物的有效控释（Science Advances, 2023）。提出3D打印自吸附干细胞支架方法，开发了细胞治疗的高效载体工具（Advanced Science，2023）。

（3）在器官体外再造研究中，与陈昶教授团队合作实现了长段活性气管重建，证明了工程化制造的器官能够移植并长期存活（Science Translational Medicine，2023）。

文章来源：
https://www.nature.com/articles/s44222-024-00218-w