骨具有强大的自我修复的能力，但无法完全修复大体积的骨缺损。全世界每年骨缺损的患者数以千万计，因肿瘤和创伤而造成的大体积骨缺损是临床上进行骨修复和移植的主要原因。治疗骨缺损最理想的材料就是自体骨，但是自体骨来源有限，同时增加了患者的痛苦，不能满足临床需要。骨组织工程的出现，为这一难题提出了新思路。骨组织工程基本出发点是以“诱导成骨”的方式而非单纯以“爬行替代”的方式实现骨的修复和再生。近年来，随着骨组织工程的研究深入，支架材料的制备以及其制备的方法也成为研究重点。 骨组织工程支架的传统制备方法包括溶液浇铸/离子洗出法、原位成型法、静电纺丝法、相分离/冻干法、气体成孔法等，虽然这些工艺也获得了但比较满意的效果，但不能实现对支架材料和孔隙结构的精确控制，结构形状也无法做到与骨缺损部位的解剖结构完全契合，从而不能实现个性化植入物的制备。
3D打印技术的出现，有效地弥补了这些不足，迅速在骨组织工程支架成型中得到广泛应用。3D打印技术为快速成型技术的一种，是一种基于三维数字模型，应用粉末状或液体的金属或塑料等可黏合材料，通过逐层打印方式来构造实物的技术。由于其无需模具，可直接根据计算机三维图形数据“打印”出任何形状物品，甚至能够控制所打印物品内部细微结构，这使3D打印技术在构建骨组织工程支架的优势得以体现。虽然3D打印技术应用于骨组织工程支架的构建具有很多优势，但仍处于起步阶段，应用于临床扔面临很多挑战。 本篇综述主要包括4个部分，分别为骨组织工程支架、骨组织工程支架中的3D打印技术、用于3D打印构造骨组织工程支架的材料和讨论。
1 资料和方法
1.1 资料来源
第一作者应用计算机检索1990年1月至2015年2月MEDLINE数据库、Science Direct数据库、中国期刊全文数据库、维普中文期刊网等有关3D打印技术在构建骨组织工程支架中应用的文章，英文检索词“three-dimensional printing， tissue engineering，rapid prototyping technology，scaffold， materials ”， 中文检索词“3D打印、组织工程学、快速成型技术， 支架、材料”，排除重复性研究。共检索到52篇相关文献，其中外文文献40篇，中文文献12篇。
1.2 纳入和排除标准
纳入标准：
①文章所述内容需为骨组织工程支架构 建的论著或综述类文章，以及与3D打印技术领域研究成果相关的文章。
②同一领域选择近期发表或在权威杂志上发表的文章。
③文章述及3D打印技术应用于支架构建及两者之间的关系，阐述其特点及优越性并提供充足的理由。
④在涉及材料对比与选择实验的文章中，选择设计合理、干预和对照的措施明确的实验设计文章。
排除标准：
①重复性研究。
②实验设计不合理的文 章。
1.3 数据的提取
计算机初检得到52篇文献，阅读标题和摘要初筛，排除中英文文献重复报道的内容，及与3D打印或骨组织工程支架不相关的内容。
2 结果
2.1 纳入资料基本概况
符合纳入标准的33篇文献中，文献是关于骨缺损治疗相关报道，文献是有关传统支架制备方法的相关报道，文献是关于支架所需具备的条件相关报道，文献是关于3D 打印技术优势及要求的相关报道，文献是关于不同材料的特性及应用进展的相关报道，文献是有关3D存在局限性与未来发展方向的相关报道。
2.2 纳入资料的研究结果特征
2.2.1 骨组织工程支架
在骨组织工程的3个基本要素中(种子细胞、支架材料和生长因子)，支架材料无疑有着举足轻重的作用，因为一方面，它是信号分子或靶细胞载体，另一方面，它还提供了新骨生长的支架[8]。 在骨组织工程中，理想的支架材料应具有以下条件：
①骨传导性：材料能为新组织的生长提供通道或媒介的能力。
②骨诱导性：材料可以刺激骨组织的生长。
③良好的生物相容性：材料能促进种子细胞的黏附和增殖分化。
④良好的生物降解性。
⑤足够的力学性能。
⑥三维多孔结构，能为种子细胞的生长提供空间。
⑦较易加工和消毒性能等。
而对于支架的设计，需考虑以下3个方面：
①能为细胞提供黏附、分化、增殖或迁移的基础，支架的孔径尺寸及结构、孔隙率以及表面化学性质是影响因素。
②合适的力学强度。
③符合取代部位的解剖学形态。
图1 3D打印基本流程
图注：图中A，B为第1和第2步：滚轴将薄薄一层原料粉末铺在工作台上；C为第3步：喷头将含有黏结剂的液滴局部喷在粉末床上， 黏结剂周围的粉末与黏结剂结合，使喷过黏结剂周围的粉末局部凝固，构成最终成品三维结构的一小部分；D为第4步：铺有原料粉末的 活塞上升，而铺有样品粉末的活塞下降，开始铺新的一层粉末(重复第2步)，如此反复，直到完整的3D结构被打印完全。
另外，普遍认为3D骨支架孔隙率应大于40%-60%以利于细胞快速扩散和细胞营养物质的流动，同时有利于细胞的转移。所以设计与制备支架时需注意与重视骨组织工程支架的要求，选择最恰当的方法与材料。
2.2.2 骨组织工程支架中的3D打印技术
3D打印技术概况：3D打印技术是最早于1989年由麻省理工学院的Emanual Sachs等报道，是一种按需喷射的微滴喷射技术。3D打印系统是在廉价的商用打印机系统上加以改进，增加z轴的运动控制系统，采用系统原有的喷墨装置或经过改装的注射器阵列实现材料的离散形成。利用这种技术在制备骨组织工程支架时，一般通过打印机将储存于其中的具有骨修复功能的粉末材料和黏结剂逐层打印出模型结构，黏结剂用于将粉末粒子之间和层与层之间黏结，使其更加稳固，最终可形成所需要的骨组织工程三维支架材料。打印材料的微观结构可以通过很多参数进行调节，例如改变黏结剂的流速，打印的速度及沉积位置等。
3D打印技术相较于其他快速成型技术，具有的优势有：
①高精度：即高分辨率。
②可以同时打印种子细胞和支架材料，更利于整体三维结构的构建。
③构建速度快。
④可按需构建模型，实现个性化需求。
⑤可根据需 要设定特定的孔隙率、交联，可显著提高支架的生物学及力学性能从而促进骨组织生长及骨折愈合。另外，从材料的角度来说，几乎所有种类的粉末只要能够与黏结剂结合都可以被用来打印。
3D打印的可伸缩性又使得所打印物品的大小可以从几毫米到几米。这些特性大大增加了3D打印使用的自由度[14]。这些优点为3D打印技术应用于骨组织工程支架构建提供了理论基础，也成为投入大量研究于此方法的意义所在。 3D打印技术基本流程：简单概括为：铺撒粉末、单层印刷、活塞下降、往复运动和印刷形成5个阶段，基本流程如图1所示。
3D打印应用于支架构造的要求：3D打印应用于支架构造时，所用粉末和黏合剂需具备一定的条件。粉末要具有一定的流动性、稳定性和可湿性。而粉末与黏合剂之间的反应性在3D打印中也起到重要作用。
⑴流动性：所用粉末材料要具有一定的流动性。良好的流动性可以保证滚轴可将粉末铺成薄薄的一层，同时也利于最终除去多余的粉末。另外，良好的流动性提供了高分辨率的打印效果，也成为3D打印高精度特性的深层原因之一。 流动性主要取决于粒子大小和形状，粒子越小、形状越类似球形，则流动性越大。有研究证实分辨率至少是粒子大小的2倍，所以高精度的打印效果依赖于选择细小的粉末。然而，过小的粉末由于内部特殊作用力的原因容易结块，导致流动性减低。所以在流动性与分辨率之间必须找一个平衡点。
⑵稳定性：粉末的稳定性在喷黏结剂时尤其重要。当喷头喷黏结剂时，体积大约30 pL的液滴以6 m/s的速度冲击松散的粉末床，这样会形成类似弹道的一个凹陷，底部是液滴。速度每增加1 m/s，则受影响的范围直径增加5-10 μm。 当重新涂布时，最上面一层收到剪切力的影响，很有可能造成所打印出的薄层结构移位，影响最终成品的准确度和完整性。除了此种横向移位，由重力所产生的压缩负荷会使所打印出薄层结构的纵向位移。因此，提高稳定性、避免这些影响可以从提高黏合强度入手，如添加少量水或者增加粉末床的堆积密度。
⑶可湿性：粉末的可湿性是另一项重要的要求，它直接影响了打印精确程度和三维结构的原始强度。但太强的可湿性又造成黏结剂扩散范围太大，降低了打印分辨率。而太弱的可湿性则会由于太大的接触角或黏结剂的高黏度而造成相邻层之间的错位，最终降低机械完整性。 粉末的可湿性取决于多种因素，包括粉末与黏结剂的接触角、黏结剂喷射速度、粉末床表面的形势以及粉末与黏结剂之间的化学作用等。目前很难得到可靠的数据来定量分析物体的接触角，尤其对于粉末更加困难。虽然有一些方法用来研究粒子与黏结剂之间的相互作用，如动力学液滴形状分析，毛细上升方法，粒子流动的方法，但仍处于初级阶段，理解尚浅。
⑷反应性：粉末与黏结剂的反应性在3D打印中也起到重要作用。太高的反应性会限制黏结剂的扩散，而低反应性需黏结剂涂布更加集中。所以反应性能够影响层与层之间的黏合，最终影响打印的精确度。 对于那些完成3D打印后需经烧结处理的支架来说，因为黏结剂受燃烧影响受损会导致最终成品的强度降低。因此想保证足够的的机械稳定性和强度，就必须降低黏结剂的集中程度。
2.2.3 用于3D打印构造骨组织工程支架的材料
骨组织工程支架构建的材料根据其性能主要包括人工合成多聚体类、天然高分子聚合物、生物陶瓷及它们的混合物。目前应用最多且最有应用潜力的为生物陶瓷材料，以下作重点介绍。
人工合成多聚体：这类材料以聚乳酸(PLA)，聚羟基 乙酸(PGA)及其共聚物(PLGA)为代表。这类聚合物属热塑性材料，可加工成各种结构形状，并且可以通过调增分子量、选择不同聚合方式及成型手段调节并控制材料的力学性能和降解速度。因其降解产物无毒及良好的生物相容性，PLA和PGA已经通过美国FDA的批准，许可 作为植入物。
Vacanti等首先将PGA、PLA用作软骨细胞体外培养基质材料，通过组织工程方法获得新生软骨成功。Sherwood等通过3D打印技术，制备了上层组分为PLGA/PLLA，下层为PLGA/TCP的软骨-骨复合支架。研究发现软骨细胞更倾向于黏附于支架的软骨支架区，培养6周后可以看到软骨组织的形成。支架的成骨区力学强度可以达到与人新生松质骨同一数量级。该研究为完全关节重建技术提供了一种新的方案。
Tay等用3D打印技术将聚己内酯和聚乙烯醇的混合粉末制成准支架，然后再用微粒过滤法将聚乙烯醇除去得到多孔的支架。过滤后的支架疏松柔软，孔的结构具有高的连通性。 但是人工合成多聚体一般水溶性差，所以溶解其需用到有机溶剂(如氯仿)。氯仿是一种有毒的溶剂，残留在体内会产生毒害作用。虽然利用氯仿提取技术可以减少氯仿，但是仍存在氯仿残留在支架内的风险。另外有机溶剂的使用明显增加了成本和生产难度，为大规模批量生产医用级支架材料制造了难题。
天然高分子聚合物：天然高分子聚合物包括胶原、 纤维蛋白、甲壳素及其衍生物和藻酸盐等，这些天然聚合物生物相容性好，具有细胞识别信号(如某些氨基酸序列)，利于细胞黏附、增殖和分化。天然高分子聚合物一般水溶性较好，可以与无需溶剂溶解的黏结剂结合。所以大量的天然高分子聚合物用于医学支架材料的打印。但它们存在一些缺点，如难以大量获取、降解时难以控制等，故很难单独作为组织工程中成骨性细胞种植的载体。但其最大的缺点是缺乏一定的机械强度，难以单独用作成骨细胞培养基质材料，可作为良好的材料包埋和添加剂。
生物陶瓷：以磷酸三钙(tricalciumphosphate，TCP) 和羟基磷灰石(hydroxylapatite，HA)为代表的磷酸钙盐陶瓷是广泛应用的骨替代材料之一，它们都具有优异的骨传导性能，可不同程度地整合入宿主骨。磷酸三钙在人的骨骼中普遍存在，是一种良好的骨修复材料。 磷酸三钙植入人体后，能在体内降解为新骨的形成，提供较丰富的Ca和P[25]，由于此特性，以磷酸三钙为基料的人工骨材料的研究与应用也是当今骨组织工程支架发展的活跃领域。但是，单纯的支架的打印似乎已经无法满足对最后成骨效果的期待。
近年来，支架载药已成为研究热点，通过添加药物的方式来调节微环境，促进成骨细胞的增殖。袁景等利用3D打印的方法，以β-磷酸三钙粉末为原料，以磷酸二氢钾为黏结剂，制备载药(地塞米松、β-磷酸甘油酸钠、维生素C)骨组织工程支架，并与未载药支架作对比，结果显示载药β-三磷酸三钙支架在15周内基本降解完全，与松质骨缺损修复时间相当。骨髓间充质干细胞黏附于载药β-三磷酸三钙支架表面，并深入支架内部，生长良好，增值活跃，细胞碱性磷酸酶活性有提高，说明载药β-三磷酸三钙支架具有良好的细胞相容性。另外，将两种生物陶瓷材料混合也呈现比较好的效果。Zhou等 将磷酸钙(CaP)与硫酸钙(CaSO4)混合粉末做为原 料，利用3D打印组织工程支架。结果发现磷酸钙与硫酸钙比率越高，则支架的强度越大。
羟基磷灰石也是广泛应用于骨组织工程支架的材料。Fierz等以羟基磷灰石和水溶性黏结剂为材料，采用3D打印技术制备了3种类型的圆柱状中空骨支架，支架直径3.9-4.2 mm，中心管直径0.70-0.87 mm，所有支架微孔含量达70%，组织学分析发现成骨刺激祖细胞可较好地附着于支架。羟基磷灰石一大优势是对骨形态发生蛋白具有较强的亲和性，Jun等在羟基磷灰石骨组织工程支架中加入含有骨形态发生蛋白2的涂层，并与不含骨形态发生蛋白2的羟基磷灰石支架作对比，结果发现实验组的成骨细胞更加活跃，且骨组织生长情况更好，更加适合作为骨移植替代物的选择。而羟基磷灰石的弱点在于脆性较大，而纯羟基磷灰石不易被吸收，这限制了其应用。
在生物陶瓷粉末的3D打印中，常用酸来做黏结剂如磷酸和柠檬酸。少量未反应的酸黏结剂残留一般来讲不会产生很大的影响。一些酸如柠檬酸、磷酸和草酸也存在于正常人体内，也很容易除去 。刚打印成 型的支架很脆，性质不稳定，为使其更加兼顾稳定，则需在打印完成后将其浸泡在磷酸中使其硬化，或者采用烧结的方法使钙磷石热分解而逐渐形成焦磷酸 盐，硬度增加。 人工合成多聚体材料因其降解产物无毒及良好的生物相容性，已被广泛应用于骨组织支架，但是由于其水溶性差而需有机溶剂的引入，使支架内残留毒性物质的风险增加，限制了其发展。天然高分子聚合物则水溶性良好，无需有机溶剂的使用，而缺乏机械强度是其最大的缺点，但可作为良好的材料包埋和添加剂。 生物陶瓷既有良好的生物相容性，同时又兼具足够的机械强度，已成为应用最广泛的骨组织工程支架材料之一，而几年来支架载药的研究又为其提供了新的发展方向。
3 讨论
3D打印技术应用于骨组织工程支架已取得了可喜的成果，并且蕴含着不可估量的前景。但是目前来讲，3D打印应用于骨组织工程支架并不是完美的，仍需认识到其存在的问题与不足。 3D打印的费用比较昂贵，不仅打印设备及运行费用较高，其材料从前期粉末的制成到后期的烧结过程中的 花费也不容忽视，打印1个头颅模型的花费高达 1 000-2 000美元，这种花费对于中国国情来说并不现实，也限制了其在国内的发展；实现个性化定制虽是3D打印的一项优势，但是，从另一角度讲不利于大规模批量的商业生产；由于3D打印最初用于工程学而并非医学，应用于支架的构建时是一个跨学科的过程，涉及两个领域的专业知识，而目前医学研究人员与工程学研究人员的研究领域和知识构架相对独立，缺乏专门的技术人才，这也是今后3D打印更广泛应用于医学所必须解决和改善的问题；另外，在不同粉末材料的选择上并无统一的标准，在分析各材料的优劣性时仍无系统可靠的指标或缺乏充足的实验证据，仍需进一步研究从结构、功能、临床效果等多方面来综合评价其材料的优点与缺点；3D打印后的支架需保持一定的生物相容性，如何增加材料的生物相容性及更接近体内微环境的模拟仍需进一步探索；细胞在3D支架材料内部的粘附、生长、分化与细胞与环境的作用机制仍需大量研究来阐明。
未来3D打印技术应用于骨组织工程支架的发展方向主要包括以下3个方面：
①结构设计和制造：制备与正常骨组织具有相似的物理、化学和生物学功能，具有一定生物相容性兼具一定的生物强度。
②多种细胞和生长因子的交互作用：考虑各种细胞以及生长因子的作用，可适当扩大打印的单位，直接打印出带有血管的骨支架。
③生物支架的保存和活性维持：需要充分考虑如何最大程度维持离体骨支架的细胞活性。
挑战与希望并存，文章看到3D打印技术在骨组织工程支架中的应用具有巨大的前景，只有同时接受存在的挑战并逐渐克服，才能发挥其最大的价值，为未来治疗骨缺损提供效率高疗效好的治疗方法。随着3D打印技术的不断发展、人们对骨组织工程支架材料的研究、工程学与医学的不断交融和相互促进，在不久的将来3D打印一定会在骨组织工程支架的构造领域中大放异彩。
编辑：南极熊
作者：于 强，田 京
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