Nature子刊:光固化丝素蛋白墨水生物3D打印

3D打印快讯
2020
02/17
13:49
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来源: EngineeringForLife

投影式光固化3D打印(DLP)是一种通过光激发,分层固化的3D打印技术,具有高分辨率、可实现复杂结构精细打印的特点。与挤出式3D打印不同,DLP为无喷嘴打印,其过程不会对生物墨水中的细胞产生大剪切力,因此可获得较高的细胞存活率。在DLP打印过程中,虽然可以通过调控光强、曝光时间、引发剂类型和浓度等来调节固化动力学。但是,生物材料自身特性才是DLP生物墨水可打印性的决定因素。

来自韩国哈林大学医学院的Chan Hum Park和美国威克森林医学院的Sang Jin Lee团队首次合成了一种光固化生物墨水材料:甲基丙烯酸缩水甘油酯改性丝素蛋白(Sil-MA)。研究发现,Sil-MA具有优秀的载细胞DLP打印性能、良好的成软骨能力及与天然软骨相匹配的机械性能。相应研究成果分别发表于期刊Nature Communications和Biomaterials上。

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图1. Sil-MA合成原理及其制备过程示意图[1]。

丝素蛋白(SF)来源于蚕丝的脱胶处理,具有良好的生物相容性、可生物降解性、高拉伸强度等特点,已被用于各种生物医学领域,包括伤口敷料、人造血管、细胞培养等。研究团队通过甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)对SF进行甲基丙烯化改性,在SF分子上引入双键。由于SF分子特殊的空间结构,其在改性前极易形成结晶而难溶于水。由于引入额外的化学基团,SF-MA分子不易结晶,可在水中溶解,这使SF-MA可形成光固化水凝胶。

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图1. Sil-MA墨水DLP打印示意图及不同浓度Sil-MA光固化水凝胶压缩、拉伸性能[1]。

在进行DLP打印复杂结构前,该团队研究了不同浓度DLP打印Sil-MA光固化水凝胶的机械性能。研究人员发现当紫外光强为3.5 mW/cm2时,每一层溶液的固化时间小于3s,这有利于提高打印速率。打印水凝胶的压缩模量随Sil-MA浓度和应变的增加而增加。Sil-MA浓度每增加10%,压缩模量就会增加约2.6倍(图1 b、c)。对于浓度30%的Sil-MA水凝胶,压缩破坏应力高达910 kPa,其足以支撑重达7 kg的壶铃,并在壶铃取下后立即恢复其原始形状(图1 d)。Sil-MA水凝胶水凝胶同样具有很高的拉伸强度,浓度为30%时,其拉伸断裂应力可达50 kPa。Sil-MA水凝胶优良的机械性能使其可经受简单的外科缝合而不撕裂(图1 g、h)。
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图2. 30% Sil-MA多孔结构DLP打印分辨率测试[1]

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图3. 30% Sil-MA墨水通过DLP技术打印的微孔支架及埃菲尔铁塔模型[1]

随后,研究人员测试了Sil-MA墨水的DLP打印分辨率及复杂结构成型能力。从图2孔道结构水平和垂直方向打印测试可以看出,垂直孔道可实现约100μm的打印精度,水平孔道可实现约200 μm的打印精度。研究人员利用Sil-MA墨水分别打印了多孔三维支架和埃菲尔铁塔模型(图3),从实物图可看出:孔道直径700μm及1mm的多孔支架贯通性良好,高度5cm的埃菲尔铁塔模型具有规整的外形。

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图4. 与GelMA相比,不同浓度Sil-MA水凝胶内3T3成纤维细胞生长及增值情况(a、b,标尺500 μm),载细胞DLP打印不同结构水凝胶及其内部细胞分布图(c~f,标尺5 mm)[1]。

以水凝胶模拟细胞外基质三维培养细胞,细胞的存活及增值是评价生物墨水性能的重要指标,研究者将浓度为10、20、30%的Sil-MA与已知具有优异生物性能的甲基丙烯酰化明胶(GelMA)作对比。实验发现Sil-MA水凝胶中的细胞生长状态良好,且浓度30%Sil-MA凝胶中细胞的增殖能力与10% GelMA对照组基本相同(图4a、b)。

载细胞DLP打印最大的技术挑战是墨水中细胞的沉降,这造成细胞无法在支架中均匀分布。在后续的载细胞打印实验中,研究人员测试了Sil-MA不同形状样品及多细胞分区打印性能(图4c~f)。从激光共聚焦扫描结果看,细胞较为均匀的分布于打印支架中,无明显分层。图4f展示了一个具有四层结构、两种颜色标记细胞的DLP打印支架。

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图5. 负载人软骨细胞的Sil-MA水凝胶DLP打印及体外、体内实验过程[2]。

经过材料合成、机械性能、打印性能、生物相容性等研究后,该团队又进行了更深层次的体内外生物学评价-软骨组织工程。

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图6. 载鼠NIH 3T3成纤维细胞DLP打印Sil-MA支架纵剖面细胞分布染色图(A,比例尺:1 mm),细胞计数统计(B)[2]。

研究人员将DLP打印的载有NIH 3T3成纤维细胞Sil-MA支架在体外培养,并在0、4、7天对支架进行切片染色观察并进行细胞计数,结果如图6所示。荧光照片显示细胞在支架的上部与下部分布均匀,细胞计数显示同样的结果,且培养第7天细胞有增值的趋势。

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图7. 兔气管、纯Gel-GMA、纯Sil-MA、载软骨细胞Sil-MA水凝胶支架在不同体外培养时间后的三点弯曲测试数据[2]。

为了确定人工气管的机械强度,对体外培养1-2周的纯GMA改性的明胶(Gel-GMA)、纯Sil-MA、载软骨细胞Sil-MA水凝胶进行三点弯曲测试,以天然兔气管作为对照,结果如图7所示。体外培养1周和2周后不含细胞的Gel-GMA水凝胶强度比天然兔气管弱,不含细胞的Sil-MA表现出同样结果。但是不含细胞Sil-MA水凝胶的强度取决于体外培养的时间。此外, Sil-MA水凝胶在负载细胞后表现出更高的强度,且随培养时间增加。载细胞的Sil-MA水凝胶在体外培养后具有与天然兔气管相似的强度。

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图8. 负载人软骨细胞Sil-MA水凝胶体外培养后切片染色图及硫酸糖胺多糖(sGAG)含量、相应软骨细胞特异性基因凝胶电泳图[2]。

对体外培养的载软骨细胞Sil-MA水凝胶进行组织切片苏木精和曙红(H&E),马森三色(MT),番红O(SFO)和PKH67染色(图8)。在培养的第一周,Sil-MA水凝胶中出即现了软骨细胞结构和形成了新软骨,且随着培养时间延长,细胞数量及生成的软骨量持续增加。切片染色结果显示Sil-MA水凝胶可为软骨细胞提供良好的的生长和成软骨环境。图8中软骨细胞分泌的糖胺多糖及软骨细胞相应基因学水平测试结果同样表明,Sil-MA水凝胶可为软骨基质的生成提供有利条件。

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图9. 载软骨细胞DLP打印支架植入兔气管实验图及植入6周后的组织切片图[2]。

最后,研究人员将DLP打印的载软骨细胞支架体外培养一周后缝合到兔气管缺损处(图9)。初期,Sil-MA水凝胶与周围组织不够吻合,使腔体变窄。随着移植期延长,周围组织长入手术部位,使凝胶成为气管的一部分,气管内径逐渐增加。移植后第6周进行H&E和MT染色,结果显示在Sil-MA水凝胶内形成了新的软骨。此外,Sil-MA水凝胶周围发现了扩展的上皮基质。人工气管的移植结果表明,Sil-MA水凝胶替代了气管的缺损部分,并引导了气管的再生。

参考文献:
[1]   Kim SH, Yeon YK, Lee JM, et al. Precisely printable and biocompatible silk fibroin bioink for digital light processing 3D printing [J]. Nature Communications, 2018, 9(1): 1–14. DOI: 10.1038/s41467-018-03759-y
[2]   Hong H, Seo YB, Kim DY, et al. Digital light processing 3D printed silk fibroin hydrogel for cartilage tissue engineering [J]. Biomaterials, 2020, 232: 119679. DOI: 10.1016/j.biomaterials.2019.119679


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