生物3D打印路线图重磅发布 （想了解它的现在与未来，看这一篇就够了）

来源：上普生物

近期，生物3D打印领域一众大咖们在本领域知名期刊Biofabrication上发表文章生物3D打印路线图（The Bioprinting Roadmap），从生物3D打印的各个层面提出目前现状、存在的问题与未来的可能路径。无论您想全面了解生物3D打印，还是试图探索本领域的新方向，看这一篇就够了。

IOP官方下载量已破5000，当之无愧开年最火生物3D打印综述。

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本文共11个小节，每一节由一位或多位行业资深学者撰写。全文近万字，满满干货，阅读时间大约需要20-30分钟，可收藏慢读，文末更有英文原文下载链接。

本文的全部作者

为方便大家查阅，特在此列出简要目录，帮助大家定向阅读。

1. 关于生物3D打印
2. 从细胞增殖到细胞打印
3. 生物墨水的开发
4. 干细胞的3D打印
5. 细胞团簇与类器官的大规模高效生产
6. 血管系统和组织构建的策略
7. 用于疾病研究的体外生物学模型
8. 器官芯片的开发
9. 多细胞工程生命系统
10. 太空上的生物3D打印
11. 生物3D打印工艺


关于生物3D打印
作者：Wei Sun
美国爵硕大学终身讲席教授
Biofabrication主编
上普生物首席科学家

生物3D打印作为生物制造的核心技术，其运用细胞、蛋白质、生物材料等作为构造单元，以构建生物学模型、生命系统和治疗产品。作者从构造单元层面上提出了生物3D打印的五个阶段：

第一个阶段是无生物相容性材料的打印，如树脂、塑料等，主要用于外科手术设计模型或是牙科手术规划；

第二个阶段是打印具有生物相容性但不能降解的材料，如金属，主要用于不可降解的假肢移植物；

第三个阶段是打印具有生物相容性可降解的材料，如可降解的高分子材料，例如骨组织工程支架、人造皮肤修复体以及心脏支架等；

第四个阶段是打印活性细胞，这类材料可以用来构建体外生物学模型、药理/病理模型、器官芯片等；

第五个阶段是打印类器官，如人工的生命系统、微型生理系统、细胞机器人等

生物3D打印的五个阶段

作者指出，虽然生物3D打印在近几年蓬勃发展，但是从技术层面仍然有几大限制：

1. 生物墨水：我们仍需具有多功能性、对细胞友好的墨水用于生物打印

2. 打印工艺：我们需要更好的工艺和打印机，来制造高存活率和高精度兼顾的模型

3. 交联技术：我们仍需更快、更强的交联剂，来保证打印体完整性和稳定性

4. 细胞培养：我们需要借助微流控技术来制造更长期的生理模拟系统

本文涉及生物3D打印领域各个分支研究方向，包括细胞增殖、生物墨水开发、干细胞打印、类器官生产、血管构建、体外模型、器官芯片、多细胞工程生命系统、太空生物打印与生物3D打印工艺。

生物3D打印随着这几年各领域人才的通力合作，已经在各个应用领域都有很有深度的发展和演变。这也是本篇文章的宗旨：旨在通过提供各领域权威专家分享的现状和建议，为各位研究人员未来研究提出建设性意见。

从细胞增殖到细胞打印
作者：Binil Starly，Edward P Fitts：美国北卡罗莱纳州立大学

生物3D打印目前的常规流程往往从细胞培养开始，所以细胞扩增成为了生物制造过程中极为关键的上游工艺。基于生物反应器的细胞扩增方法有望代替传统的方法。现有的生物反应器系统来自于疫苗或抗体的生产工艺，然而当活细胞作为反应器的最终产物时，该系统需要更精密的设计。

作者提出目前的细胞培养存在以下几点问题：

1. 目前细胞培养普遍采用2D的培养皿进行培养，但是如果需要收获数量可观的细胞以实现用于治疗用途的生物3D打印，2D的培养形式需要较大的空间，十分不方便。

2. 目前市场上的生物反应器缺乏实时跟踪细胞分化时的状态，细胞在反应器内处于“黑匣子”状态，研究人员难以判断。

3. 由于生物3D打印往往会应用病人自身的细胞，常规的细胞培养流程可能难以适用。

4. 在装入生物3D打印机前的细胞操作是缺乏监控的，容易造成细胞状态的变化。

针对上述问题，作者提出以下技术路线的建议：

1. 细胞培养平台与细胞增殖生物反应器相结合，以提升细胞产量和速度

2. 多种传感器需要在反应器中应用，以确认细胞状态、数量等

3. 需要建立数据模型以实现细胞状态、形态等特征的共享

总得来说，随着新技术的加持，下一代细胞培养需要更高效、更自动化、更智能。

生物墨水的开发
作者：AndrewC Daly，Jason A Burdick：美国宾夕法尼亚大学
Jürgen Groll：德国维尔茨堡大学

生物3D打印所使用的材料被称为“生物墨水”，随着行业的发展，生物墨水这个概念已经得到了极大了延伸。作者提出，生物3D打印实质上是将生物墨水由液态转化为固态的过程，其流变性能以及生物相容性是成功打印的关键。

作者提出目前的生物墨水存在以下几点问题：
1. 研发出具有可打印性的生物材料
2. 打印前后可以保持细胞活性
3. 可以提供适合细胞行为的细胞微环境

总的来说，如何平衡打印性、细胞活性和功能是生物墨水开发的一大难题，同时细胞增殖和结构稳定性也是要考虑的要点。

微挤出式打印工艺是目前最常用的打印工艺，其通过挤出外力（气动或电动）将材料通过喷嘴挤出成连续的丝材，并堆积成结构。例如GelMA这类光敏墨水在挤出后通过蓝光或紫外光进行固化交联；又如一些剪切变稀材料，可以在挤出过程中直接实现流变性能的转化。

激光光刻式打印工艺（如SLA、DLP等）因其高精度而被广泛使用，然而其打印大尺寸材料所需时间较长，所以如何保证细胞活性是一大难点。

1. 开发新型的复合生物3D打印工艺，针对墨水的不同交联方式，复合打印工艺，实现分步交联，达到打印目的。例如，通过透明针尖打印HAMA与GelMA的混合材料，进行原位打印；或是通过同轴喷头打印海藻酸钠类材料，以实现快速交联。

2. 开发适用于现有打印工艺的新型墨水，如悬浮胶的设计可以用于打印低黏度材料如PVA；亦或是新型剪切变稀水凝胶的开发。

新型生物墨水全方位提高打印体的可能性

总之，墨水的开发与工艺息息相关，二者的研究同步进行才能取得突破性成果。未来的研究应着眼于生物墨水如何控制细胞行为，以主动协调细胞，快速实现功能性组织成熟。

干细胞的3D打印
作者：Gregor Skeldon, Wenmiao Shu：英国思克莱德大学

干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。干细胞的研究十分具有现实意义和潜力，所以研究者们开始尝试生物打印干细胞。

作者提出目前的干细胞打印存在以下几点问题：

1. 干细胞，特别是多功能干细胞非常脆弱敏感。由于打印过程的剪切应力较大，所以干细胞在打印过程中容易死亡，特别是高黏度的材料打印。

2. 生物墨水的配置对于干细胞来说至关重要，一方面干细胞需要足够的营养和养分通道，需要生物墨水具有多孔空隙；另一方面要形成三维结构，需要生物墨水提供支撑，而空隙会降低其力学支撑性能。所以墨水的设计需要在这两者中找到平衡。

3. 在三维环境下实现可控的干细胞分化是一大生物学难题，另外如何实现组织级细胞密度也是打印干细胞是需要解决的问题。

作者提出目前几种技术可以帮助研究者克服上述难题：

1. 人体胚胎干细胞（hESCs）或人体诱导性多功能干细胞（hiPSCs）可以通过微阀喷射的方式打印或是激光诱导正向传输（LIFT）方法避免针头的使用以降低剪切应力。

2. 有些研究者通过在墨水中添加粘附肽或是生物活性凝胶如Matrigel，羧甲基壳聚糖（CMC）等以增强干细胞的细胞存活率、功能性和强度。

3. 墨水中加入牺牲墨水如羧甲基壳聚糖（CMC）可以增强干细胞打印体中的孔隙率，方便营养物质的流通和干细胞的分化。

同时，作者提出，打印出干细胞离临床、工业应用还有很远的距离，干细胞的使用还会引发畸形瘤的潜在危险，所以产业化涉及规模、质量控制等方方面面。总的来说，由于干细胞的生物学功能还未彻底的研究投产，生物打印干细胞还有许多难题需要克服，不过随着新的打印方法和材料的应用，相信这些难题可以迎刃而解。

细胞团簇与类器官的大规模高效生产
作者：Yasuyuki Sakai，Marie Shinohara，Masaki Nishikawa：日本东京大学

类器官（Organoids）由于其极好的生理学相似性，被应用在微组织的构建和研究中。然而，类器官的应用有诸多现实的问题。

类器官的生产往往是静态培养，由分离的单细胞的在特定空间内重新聚集开始，这样的方式可以轻松控制高均匀性的类器官尺寸，但这一方法不适合大规模生产。从规模化角度来看，团簇悬浮生物反应器是比较适合的方法。然而使用这种悬浮培养，控制、诱导和保存类器官要比静态培养困难得多，所以如何能将可靠性和生产规模结合起来，是一个难题。

静态培养（a）与悬浮培养（b）

另一个问题在于生产类器官所使用的昂贵的生长因子，在体内环境中，生长因子由基质细胞产生和作用，而在类器官中，我们需要持续高浓度的生长因子供应，这无疑提高了整个生产成本。

在静态培养中，类器官扩散受限于氧气供应。于是作者提出使用透氧性材料如聚二甲基硅氧烷（PDMS）用于培养，可以显著增强细胞间组织和ECM产量。ECM产量的增多进一步提升了细胞团簇的密度。同时，使用透氧性材料可以保持氧气浓度，保证细胞进行有氧呼吸。在悬浮培养中，异质细胞的团簇是难以形成的，不过通过某些分子的添加（如Eudragit），可以加强细胞的附着性。

另一个高效生产的方向是高密度团簇培养，补料分批透析培养来源于传统的化学工程，是理想的的高效生产方法。这一方法可以增加细胞密度，清除出代谢产物，并通过激发旁分泌和自分泌有效降低生长因子的成本。

使用透氧性材料培养（a）与补料分批透

总之，目前类器官和细胞团簇的大规模高效量产是一个亟需解决的问题，而作者相信随着对细胞自主性的进一步理解，有助于解决上述问题。

血管系统和组织构建的策略
作者：Jinah Jang，Dong-Woo Cho：韩国浦项科技大学

人类的血管系统为人体器官提供各类养分，以维持人体的体内平衡。作者提出，生物打印重要的是如何将细胞按特定方式进行组合，打印后以诱导其自组装，从而逐渐形成组织。多喷头生物3D打印技术的提出可以有效帮助血管化的实现，通过不同内皮细胞的结构设计，可以构建出小尺寸血管通路。

虽然我们在技术上有所突破，但当制造组织级的结构，诸多问题还是需要克服的。例如打印过程的剪切应力、生长因子、如何提供生理学微环境都是目前的限制因素，作者还特别提到了打印结构和循环系统或是自身系统的端对端连接也是维持打印体的重要因素，也是目前的一大难点。

为应对以上的问题，作者提出模块化的生物打印体可以作为突破的方向。根据不同的血管化策略（如自组装、牺牲通道等方法）和血管尺寸（如分叉角度、曲折率等），将内皮细胞、基质细胞、细胞团簇和生物墨水等通过生物3D打印的方法搭建出结构体，辅以ECM生物墨水和同轴喷头的应用，可以协助血管通道的快速形成，以构建出血管化组织。

作者提出，自动化生物3D打印技术可以源源不断的提供细胞、功能以及所需的微环境，以实现大尺寸组织的构建，随着工艺不断进步，相信我们距离临床治疗和病理研究会有更深层次的理解和应用。

用于疾病研究的体外生物学模型
作者：Minghao Nie，Shoji Takeuchi：日本东京大学

在药物研究中，研究人员往往需要精准调控的体外三维细胞模型来准确判断药物反应。生物3D打印概念的提出，让这样的体外模型成为可能。

作者从两个案例中讨论3D打印体外生物学模型存在的问题：

1. 皮肤的多层屏障的作用是控制外用药物的从表皮层到真皮层下毛细血管的透皮递送。例如化妆品的毒性检测需要测量其中有害物质从皮肤到血液中的渗透量。为了可以实现这一功能，体外的皮肤模型应该具有分化完好的表皮层、由沉积膜构成的表皮-真皮屏障、成纤维细胞填充的真皮层和内皮细胞构成的内皮层。目前技术所制造的皮肤模型由成纤维细胞填充的胶原蛋白晶格（FPCL）的收缩构成，但是尚未实现毛细血管进入FPCL之中，可以实现稳定毛细血管灌注的FPCL是下一步皮肤模型构建的难点。

2. 受力形变较大是骨骼肌和心肌组织的一大特点，而由于跟腱结构的缺失，3D打印的组织收缩运动往往较小，同时，目前缺乏加入神经细胞的肌肉组织，以实现更真实的体外肌肉组织模型。

作者提出，通过混合3D打印非生命部件如高分子或电极和细胞结构可以解决以上的技术难题，通过将两者的优点相融合，实现具有刺激和反馈的组织结构。例如在皮肤模型中，加入可以牺牲的尼龙线材已形成血管网络；亦或是在构建肌肉模型中，通过3D打印柱阵充当锚碇系统，并在此之间打印肌肉细胞，以达到更大收缩力。

具有血管通路的皮肤模型

具有锚碇系统的肌肉组织

总的来说，生物3D打印是一个十分灵活的技术，可以根据应用的不同，调整技术细节，以达到“为我所用”的目标。

器官芯片的开发
作者：Serge Ostrovidov，Ali Khademhosseini：美国加利福尼亚大学洛杉矶分校

器官芯片（Organ-On-A-Chip）是将微流控系统和生物细胞相结合，体外研究其生物学关系的方法。这种方法优于常规的组织培养模型，并可以提供药物筛选数据和器官间关系的复杂生理状况。目前我们可以成功制作内皮细胞芯片、心肌细胞芯片、肿瘤芯片等各种器官芯片，其最终形态是将各器官的芯片组合起来形成人体的体外模型。

作者提出，从芯片角度来说，细胞如何在体外实现功能性是一个难点。同时，由于药物检测时往往要研究各器官的关系，一个可以为所有器官提供营养的培养基也是需要的。并且，在器官芯片上实现实时监控也是必要的，这需要多重传感器安装在芯片上以实现自动化的反馈。

从3D打印角度来说，生物墨水仍然是最大的问题之一，墨水需要保证细胞在其中均匀悬浮且具有良好的打印性，并能提供养分。而对于较大的组织，血管化是目前需要克服的一大难题。

为应对上述问题，目前研究者开发了多材料生物墨水，可以实现多种细胞的混合打印。从打印工艺来说，同轴打印也是实现血管结构的关键技术；数字微镜设备与CT结合的生物3D打印技术可以有效帮助实现大尺寸异质组织结构的血管化。近期已经有相关研究成功制造出同时具有肝脏、心脏和肺的多器官芯片，并安装生物传感器，以检测实时反馈。

多材料生物打印

多器官芯片

随着生物3D打印技术的逐渐开发，器官芯片也向着更复杂和更高的仿真度方向发展，随着人类干细胞的应用，相信器官芯片会在医药产业有更深远的影响。

多细胞工程生命系统
作者：Roger D Kamm：美国麻省理工学院

多细胞工程生命系统（MulticellulcarEngineered Living Systems, M-CELS）最早有日本的Yamanaka教授提出，随着生物3D打印和微流控技术的发展，在最近10年内有着长足的发展，是未来生物医药企业的有力而高效的工具。

M-CELS的制造往往分为两种，一种是将细胞接种到基质之中，以实现其功能，不需要细胞之间的互动；第二种是充分利用细胞的自主性进行分化和自组装。其中第二种方法还有许多未知和难题需要探寻和克服。如何实现自组装，甚至于自修复的组织结构是未来的方向。

M-CELS的生产路径图

想要实现M-CELS的构建，需要开发全新的生物打印工艺。要开发新的工艺，有几点难题需要攻克。其中一个就是生物学系统的内在机理很多还是未知的，而当前的设计和制造原则是基于已知的各种部件间的相互作用。例如，我们不甚理解一组肌肉细胞如何自组装形成肌肉组织，并可以产生集体收缩。不过即使我们不理解，我们可以创造条件，通过将它们放置在足够接近的位置，使他们自发性的相互作用。同时作者提出，例如复杂的脑类器官，如何形成血管化是一大难题。而如何实现自我修复、自我复制的生物学系统是更进一步需要解决的问题。

作者相信随着计算机辅助方法的加持，通过预测打印完成的机构体可以有效的构建合格的M-CELS。然而，作者同样认为，我们应该进一步理解整个类器官的原理，并且重新审视生物3D打印的潜能，以实现进一步突破。

太空上的生物3D打印
Vladimir Mironov：俄罗斯莫斯科第一国立医科大学
Lorenzo Moroni：荷兰马斯特里赫特大学

随着生物3D打印技术的逐渐壮大，美国、中国、欧盟和俄罗斯均开始尝试在太空进行生物打印研究。对于太空上进行生物3D打印，作者提出，微挤出式打印机依然是最常用的打印方法，打印出来的结构体暴露在太空的微重力和辐射环境下，用于研究其生物学和生理学功能。

最近，研究者们开发出了另一种磁悬浮生物打印方法，通过磁化细胞在磁场中打印，以克服微重力所带来的打印问题。通过磁场的设计，这一工艺可以实现免支架、免喷嘴的快速打印，在太空这一特定环境下，是一种十分有吸引力的新工艺。

能够升入太空的打印设备、墨水需要严格的设计和管控，以确保宇航员的安全，所以太空级生物3D打印机需要紧凑、极高的自动化和客户友好性。

专为太空生物打印设计的磁悬浮打印机

太空辐射被视为人类太空探索的一大障碍，特别是建立可持续的行星定居点的深空旅行。生物3D打印的人体组织结构可以作为一种用于监测太空辐射及其影响的前哨兵。我们已知人体的高度增值组是具有放射敏感性的，因此，干细胞，骨髓，以及生殖器官如卵巢和睾丸等器官是太空中主要打印和研究的对象。

总之，太空上的生物3D打印是极富挑战性的研究方向，也具有诸多潜力，相信随着技术的进步，我们距离在太空的定居又进一步。


生物3D打印工艺
作者：IbrahimT Ozbolat：美国宾夕法尼亚州立大学
生物3D打印工艺往往可以分为微滴式、微挤出式、激光光刻式打印工艺。每种打印工艺都有其优点和局限性：

微滴式工艺通过超声或微阀的方法产生连续或非连续的微滴机构，喷射在打印平台上，具有较高的精度和速度。但其适用的材料往往局限于低黏度材料，并且细胞密度往往不高，因为此类打印容易造成喷头堵塞。

微挤出式工艺通过挤出外力（气动或电动）将材料通过喷嘴挤出成连续的丝材，并堆积成结构，适用于多种细胞和墨水，是最常使用的生物3D打印工艺。但其精度往往不够高，100微米的精度已经是其极限，而对于细微结构的打印，微挤出式工艺难以胜任。

激光光刻式打印工艺是通过光的照射固化，大面积堆积形成结构，其精度较高。但由于其利用光进行固化交联，所以其材料的应用范围大大被缩减，而且其打印出的结构生物仿生性和细胞密度均较低。

不过随着技术的进步，我们有了更多的工艺和技术来突破上述工艺的难题。例如近期Feinberg Lab提出的FRESH悬浮胶打印，可以实现高精度的打印；Burdick Lab开发出原位光固化技术，实现墨水在喷嘴挤出前瞬间实现光固化，大幅提高其打印精度；又如LIFT光固化打印工艺的提出，可以实现复杂管状结构的打印；研究人员还将墨水通过微滴喷射到静电纺丝中，亦或是通过声泳技术，以解决其工艺的低黏度限制。

新兴的生物3D打印工艺

总的来说，生物3D打印工艺不断进步，各技术相互融合以实现各类复杂高精度结构的构建。

总结
这篇综述性文献可谓是集结了生物3D打印领域的半壁江山，而本篇文献的意义也正如本篇文章的策划人孙伟教授所言：生物3D打印的方法论和技术水平持续发展，其应用领域也在不断地升级和变换，生物3D打印路线图旨在通过提供详实的总结和建议，帮助行业资深和新入的研究人员一个思路和方向。

参考文献

Sun, Wei, Binil Starly, Andrew C. Daly, Jason A. Burdick, Jürgen Groll, Gregor Skeldon, Wenmiao Shu et al. "The bioprinting roadmap." Biofabrication 12, no. 2 (2020): 022002.

目前官网原文免费开放下载啦https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ab5158