顶刊GUT3D打印功能性肝脏实现肝衰修复

来源：上普生物

导读：肝脏是人体最重要的器官之一，是人体代谢、排毒、胆汁分泌的重要器官，由于其复杂的功能性，肝脏的治疗尤为困难和重要。北京协和医院肝脏外科毛一雷主任团队使用上普生物3D打印设备，打印出具有功能性的肝脏类器官，移植到肝衰小鼠体内后成功形成功能性血管系统，并可以有效延长肝衰小鼠的寿命，具有人肝脏的药物代谢的功能。此研究于5月20日在线发表在消化病学和肝病学领域的顶级期刊GUT（IF=17.943）上，也是生物3D打印技术目前在实际应用方面的最深入的文章。

目前掌握的信息和技术有哪些？
对于晚期的器官衰竭治疗，器官供体短缺仍是严峻的难题
生物3D打印是构建体外器官的解决方案之一
3D打印功能性组织器官及其在再生医学的应用仍是难点

本研究有哪些突破？
本研究的3D打印肝脏类器官具有肝脏功能，如白蛋白分泌、药物代谢、糖原储存等
3D打印肝脏类器官移植到肝衰小鼠腹腔后可以延长寿命，分泌肝脏特异性蛋白，并具有人肝脏的药物代谢的功能。
移植后3D打印肝脏类器官形成功能性血管网络，可以有效增强营养物质运输能力

此研究对于临床有什么影响？
此研究印证了生物3D打印技术在肝脏移植治疗中的潜在价值，我们可以通过这种技术辅以相应的细胞制造出人造器官，并将其移植到人体中并发挥正常的生理功能以治疗特定疾病。
人体的超级工厂—肝脏

肝脏是机体最大的腺体，它在机体的代谢﹑胆汁生成﹑解毒﹑凝血﹑免疫﹑热量产生及水与电解质的调节中均起着非常重要的作用，是机体内的一个巨大的“化工厂”。

肝脏承担的主要功能如下：

• 代谢与消化：肠道的血液里有糖类、脂肪、维生素、蛋白质等营养物质，通过肝脏的代谢处理后，才能被人体吸收。
• 免疫与排毒：血氧里的各种毒素、有害物质、甚至不需要的物质，通过肝脏24小时不停的工作分解破坏，最后通过肾脏和肠道排出。
• 维生素贮存与代谢：肝脏是维生素C、D、E、K、B1、B6、B12、烟酸、叶酸等多种维生素贮存和代谢的场所。
• 血液调节：正常时肝内静脉窦可以贮存一定量的血液，在机体失血时，从肝内静脉窦排出较多的血液，以补偿周围循环血量的不足。
• 然而，肝脏是唯一没有痛感神经的器官，所以对于肝脏的轻微症状没有明显的疼痛感觉。但一旦感到肝区疼痛，那就是肝脏发生肿大后牵动了周围的组织和肝的外膜所致，这样往往后果很严重。
  

3D打印肝脏类器官
对于晚期的肝病患者，有限的肝移植数量、部分体外肝支持以及通过注射肝细胞进行的小规模治疗的效果和效率都十分有限。为了可以构建出用于移植和再生医学的体外功能性肝脏类器官，需要克服几个关键点：

• 具有足够细胞量的精密结构组织
• 与体内肝功能相匹配的三维微环境
• 移植手术过程中易于处理和固定
  

毛一雷教授团队为了解决上述问题和难点，采用生物3D打印方式构建含有HepaRG细胞的三维肝脏类器官（Hepatorganoids），并在体外分化出具有白蛋白分泌、药物代谢、糖原储存等功能性的肝细胞。并将此类器官移植到肝衰的小鼠体内进一步验证其功能性。

3D打印功能性肝脏类器官的技术路线

工艺参数决定肝细胞存活
研究团队通过实验发现，材料的配比会影响肝细胞的结构稳定性、存活率以及细胞增殖。综合考虑和实验摸索后，团队选用5%明胶搭配1%的海藻酸钠作为打印墨水（上普A1同源墨水）。

生物3D打印机同样采用上普多喷头细胞3D打印系统，此设备具有成型环境温控技术，可以为打印体提供更均匀的温度传导。最终研究团队将喷头温度控制在20℃，成型环境控制在10℃进行打印，并构建出具有500微米的支架孔隙，以助于营养物质、氧气的供应和代谢废物的排泄。

媲美原代人肝的肝脏类器官
将通过对分化7天后的3D打印的肝脏类器官进行一系列肝功能检测，研究者发现，其肝功能蛋白表达（ALB、CK18、AAT、MRP2、TRANSFERRIN等）不仅远高于2D肝细胞和基质胶3D肝细胞，并且与原代人肝细胞的表达非常接近。研究者发现这是因为3D打印的肝脏类器官更好地诱导了肝特异性转录因子（FOXA2、HNF4A等）。更重要的是，3D打印的肝脏类器官分泌的白蛋白、α-1抗胰蛋白酶和因子VII与原代人肝细胞的分泌相当。

通过进一步实验，研究者发现3D打印的肝脏类器官的排毒功能依然远高于2D肝细胞和基质胶3D肝细胞，并且与原代人肝细胞相当。而在形态方面，3D打印的肝脏类器官构成团簇，并且细胞积累了糖原聚集体，说明3D打印的肝脏类器官在分化后达到了肝功能的水平。

3D打印的肝脏类器官的肝功能表达对比

显著延长肝衰小鼠寿命
为研究3D打印肝脏类器官在体内的肝脏功能，研究团队将其移植到肝衰的小鼠体内。研究表明，移植后的小鼠寿命延长了近一倍，并且由于移植的肝脏类器官具有足量的肝细胞，小鼠体重减轻现象也显著下降。并且移植后小鼠肝功能指标的血清水平也有显著上升。此研究结果表明，3D打印肝脏类器官有效的治疗小鼠的肝衰。

更加令人振奋的是，小鼠肝脏在移植14天后自发的构建出血管网络系统，这也进一步论证了3D打印肝脏类器官在移植后的体内功能性以及其确保寿命延长的心血管化的形成。

最终，为分析小鼠肝脏的药物代谢能力，研究者使用异哇胍，这种药物只有人肝细胞才能够代谢，而小鼠肝脏不能代谢。通过检测代谢产物，明确了肝脏类器官在小鼠体内具有人肝脏的代谢功能。

小鼠肝脏在移植14天后自发的构建出血管

总结
构建用于临床治疗的完整肝脏器官仍然是一个需要攻克的远期目标，但本研究成功迈出了重要一步：通过生物3D打印构建出具有体内肝功能的肝脏类器官，无论在体外还是体内都具有显著的肝功能性。小鼠肝脏在移植14天后自发的构建出血管网络系统，并有效的延长的肝衰小鼠的寿命。本文是生物3D打印技术目前在实际应用方面的最深入的文章。相信随着技术的不断精进，我们距离生物打印完整功能器官又更近一步。