MIT《先进功能材料》:3D血管化肿瘤芯片检测肿瘤药物输送

来源：高分子科学前沿

目前，治疗癌症在很大程度上依赖靶向药物，但是只有极少数的药物通过临床试验。当前临床前模型的低预测能力仍然是要克服的巨大挑战。体外技术动物模型、微流体等已经成为用于快速产生多个预测人体模型的重要工具。鉴于肿瘤微环境（TME）可以在癌症进展、药物吸收和/或耐药中发挥作用，因此微环境中的肿瘤已成为研究重点。尤其是在药物反应的情况下了解肿瘤是如何影响微血管重塑和功能的。缺乏有关TME中肿瘤与内皮相互作用的知识导致无法预测现有人类肿瘤模型。随着用于生成体外微血管的工具（包括牺牲性模具和微流控技术）的开发，研究脉管系统在肿瘤发展和转移过程中的作用也逐渐增加，包括在芯片上检查肿瘤细胞的定位和迁移。尽管许多模型已被开发，但没有一个模型能够将带有血管系统的肿瘤整合到药物中来。考虑到许多治疗化合物靶向肿瘤增殖和生存能力，有必要研究其对TME的作用。

近日，麻省理工学院的Mark R. Gillrie教授团队在《Advanced Functional Materials》上发表了Endothelial Regulation of Drug Transport in a 3D Vascularized Tumor Model，作者将3D肿瘤球体嵌入可灌注微血管网络内，文章旨在开发一种能够在生理肿瘤微环境中预测药物递送的系统。这是首次在血管系统中培养肿瘤球状体，目的是探索更具生化的肿瘤微环境中的药物传递，并研究其对内皮的影响和作用。两种具有代表性的肿瘤(卵巢癌和肺癌)在局部显著影响血管。肿瘤邻近血管的形态和通透性的改变导致了药物传递的差异，在复杂的TME和较简单的球状体之间很明显，表明需要使用更相关的TME进行药物测试。在临床上采用药物外排泵抑制剂的情况下，还对药物的递送进行了检查，以改善化疗药物的吸收，证明其受内皮调节。这种培养方法有助于研究各种靶向和生理学化合物，以及检查免疫相互作用和原发性或获得性耐药性，这些都需要存在3D血管化微环境。


1.血管化肿瘤模型的建立
为了增强癌症药物筛选的预测能力，作者开发了体外血管化肿瘤模型作为改进的病理生理平台。该模型利用两种3D体外技术作为简化的肿瘤模型，并使用基于水凝胶的微流控技术生成相关的血管化肿瘤微环境（TME）。在设备中嵌入肿瘤球体（TSs），可在可灌注微血管的情况下探测肿瘤的生长/死亡（图 1）。该系统可以直接检查TS对内皮的影响，并且可以通过血管将药物转运到肿瘤。作者使用卵巢癌（Skov3）和肺腺癌（A549）细胞来检验该平台的实用性。两种癌细胞都产生致密的聚集TS（图1B）。然后在纤维蛋白凝胶中与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）和正常人肺成纤维细胞（nhLF）共同培养。在前72小时内，单个细胞在TS存在下延伸，互连并形成血管网络，然后在第5天形成管腔。在共培养期间测量TS的生长，直径增加（图 1C，D）。

图1用于癌症特异性表征和药物传播的3D血管化肿瘤模型。

2．肿瘤特异性对血管形成的影响
除肿瘤表征外，这种培养方法还可用于研究周围脉管系统肿瘤的变化。培养7天后，两种类型的TS附近的脉管系统局部区域出现明显差异（图 2）。比起更远端的radial骨区域，与TS最邻近（近端）的区域的血管密度（血管/总面积）均降低（图2A，B）。然而，与A549相比，Skov3肿瘤导致血管密度显着降低。Skov3在靠近TS的血管网络中诱导局部凋亡区域，这与A549附近均匀分布相反（图2C）。作者认为血管密度和细胞凋亡的差异是由于两种肿瘤类型之间迁移模式或细胞因子表达的改变所致。第7天后，尽管大量的Skov3从TS表面迁移，但它们距TS的距离远小于A549（图2D）。这种迁徙反应可导致在TS附近血管死亡/密度差异，但也可能改变局部促炎性标志物浓度、代谢物和生长因子，或含有RNA或蛋白质的外来体。因此，作者使用人类细胞因子抗体阵列来研究这些差异（图2E）。结果表明A549 TS导致血管生成因子（包括血管生成素）的更高表达。

图2肿瘤细胞浸润TME，在血管系统中肿瘤相关的变化。

3.肿瘤引起的血管通透性变化
癌细胞可诱导血管通透性增加很大程度上是VEGF等信号分子引起的。作者以3D肿瘤附近和远离空间的高分辨率研究这种现象。为此，将TS与新生的血管网络共培养直至第4天，此时将单层接种到培养基通道中，最后在第7天使用荧光葡聚糖（40 kDa）将微血管灌注。通过荧光示踪剂从血管内到血管外空间的泄漏来计算微血管通透性 （图3）。与A549相比，Skov3对与TS相邻且距离更远的血管渗透性有更显着的影响，这可能是因为肿瘤相关信号的改变。此外，血管网络（TS‐MVN）培养物中TNFα浓度仅略有增加，促炎细胞因子或其他局部分泌因子可能导致屏障功能受损，但需要进一步研究。肿瘤对相邻血管重塑和通透性的局部影响将改变肿瘤药物递送。

图3 内皮渗透性受肿瘤的存在局部影响。

4. 3D化学疗法的血管运输
为了测试该系统中药物的递送效率，用紫杉醇对微血管和球体进行了处理。MVNs的渗透性仅在紫杉醇浓度增加的情况下处理1小时就显着增加（图4B）。作者比较了简单球体模型和系统之间的药物输送。紫杉醇被用于单独治疗和在血管网络（TS‐MVN）内的TS（图4C–G）。在紫杉醇治疗后72小时，肿瘤明显的细胞死亡（图4D）。对于单独的球体（TS）治疗，两种肿瘤细胞系中紫杉醇浓度的增加都会导致胱天蛋白酶信号明显升高（图4E）。Caspase 3/7强度随着紫杉醇治疗而增加（图4F）。虽然Skov3和A549 TS的半胱天冬酶强度没有差异，但与TS相邻的肿瘤外区域的细胞凋亡增加（图4G）。作者还在紫杉醇治疗后的24、48和72小时内测量了肿瘤大小（直径）（图4H），治疗后A549 TSs的总直径持续增加，而Skov3 TS的直径缩小。

图4紫杉醇治疗影响内皮和肿瘤。

5.相关TME中的耐药性
通过Western blot和流式细胞术在所有细胞类型中检测P-gp（也称为MDR1）的表达。在紫杉醇处理后，A549和Skov3中的平均P-gp表达降低，但HUVEC中的平均P-gp表达显着提高（图5A）。与A549和Skov3相比，488-Taxol的吸收更高（图5C）。肿瘤细胞中P-gp表达降低可能与其他药物外排蛋白的表达增加相对应，从而有助于耐药性。最后，在3D模型中检查了P-gp函数（图5E）,该结果表明，与不存在MVN相比，紫杉醇和P-gp抑制剂的运输都受到了MVN的阻碍。因此，P-gp抑制剂最终对所测试浓度的肿瘤中的化疗药物（488-Taxol）积累几乎没有影响，进一步证明了采用3D血管化肿瘤模型相关病理学的重要性。

图5.紫杉醇在细胞内的吸收取决于细胞和外排。

6. TME和扩散限制的药物递送
在TS‐MVN系统中，成纤维细胞与肿瘤球体密切相关（图 6A）。细胞占据了原本可以扩散的体积，并且还可能沉积大量的细胞外基质（ECM）。实际上，诸如胶原蛋白III之类的基质蛋白表达增加与耐药性相关，并在肿瘤附近强烈表达（图6B）。对于两种癌细胞类型在不存在结合情况下分子扩散性，紧邻TS且在TS自身内的直接TME基质中的扩散率显着降低（图6C）。虽然两种细胞类型在基质或TME基质中的扩散率没有差异，但肿瘤本身却存在显着差异。与Skov3相比，A549限制TS中的分子扩散（图6D）。

图6. 药物运输受肿瘤微环境影响。

【结论】
该工作的人类肿瘤芯片模型将可灌注微血管直接与肿瘤整合在一起，从而可以检查关键的转运机制。该模型证明了完整有效的血管网络对于有效药物输送的重要性，因为肿瘤引起的重塑会显着影响局部TME和脉管系统。该模型有可能进一步发展成更准确的临床前模型，以检查复杂的免疫细胞和靶向抗体之间的相互作用以及化学疗法。