清华大学孙伟团队3D打印出可进行刺激性反应的神经回路

2020年6月23日，南极熊获悉，清华大学孙伟教授团队3D打印出了能够培育神经细胞的大脑类组织结构。他们从大鼠的皮层中提取了一组初级神经细胞，并将其整合到打印的结构中，然后测试了所制造的结构。有趣的是，经过数周的体外培育，初级神经细胞已经形成了一个复杂的神经回路，能够对外界刺激做出反应。

这项研究结果已经发表在论文 "Engineering of brain-like tissue constructs via 3D Cell-printing technology "中。该论文由Yu Song, Xiaolei Su, Kevin F. Firouzian, Yongcong Fang, Ting Zhang, and Wei Sun共同撰写。

△提取神经细胞进行生物打印，图片来自清华大学。

一个活的3D模型

3D生物打印技术虽然先进，但还不能制造有用的完整器官。幸运的是，较小和不太复杂的组织结构在健康监测和药物测试方面有其用途。例如，医学专业人员能够从个人身上收集神经细胞，并将其在3D打印的网格状结构上生长成较大的培养物。这些3D结构很好地模仿了真实脑组织中的通路，因此神经细胞把它们当成了真实脑组织，并在适当的营养下，沿着它们生长。

由此产生的神经回路的行为就像一个微型大脑一样。一旦复杂到足以对刺激做出反应，就将培养物暴露在实验药物中，并记录它们的神经反应，让我们了解如果人类试用药物，实际的大脑可能会做出怎样的反应。

△3D打印的类脑组织，照片来自清华大学

生物打印大脑

研究人员必须经过几个阶段的试错，才能得到正确的结构。他们发现最佳的喷嘴直径和打印速率分别为0.51毫米和5μL/s。所得结构的弹性模量约为6千帕，并采用免疫染色成像技术跟踪打印结构上神经细胞的生长情况。

为了测试神经网络的电刺激反应，该团队直接在4×4电极阵列中培养它们。产生电场并观察神经元，显示出敏感的活动。然后用河豚毒素来测试培养物的药物敏感性，表明3D打印结构 "作为药物测试模型的潜力巨大"。

最后，研究了2D和3D结构打印时神经细胞的存活率。3D结构可以保持整整4周的活力，最初85%的细胞在生物打印过程中存活下来。相比之下，2D结构的存活率只有25%，验证了清华科学家3D生物打印脑组织方法的优越性。

△用电极阵列测试2D和3D形态，图片来自清华大学

孙伟教授及其近期生物3D打印科研成果


生物3D打印作为生物制造的核心技术，其运用细胞、蛋白质、生物材料等作为构造单元，以构建生物学模型、生命系统和治疗产品。孙伟从构造单元层面上提出了生物3D打印的五个阶段：

第一个阶段是无生物相容性材料的打印，如树脂、塑料等，主要用于外科手术设计模型或是牙科手术规划；

第二个阶段是打印具有生物相容性但不能降解的材料，如金属，主要用于不可降解的假肢移植物；

第三个阶段是打印具有生物相容性可降解的材料，如可降解的高分子材料，例如骨组织工程支架、人造皮肤修复体以及心脏支架等；

第四个阶段是打印活性细胞，这类材料可以用来构建体外生物学模型、药理/病理模型、器官芯片等；

第五个阶段是打印类器官，如人工的生命系统、微型生理系统、细胞机器人等

生物3D打印的五个阶段

今年4月份，清华大学深圳国际研究生院弥胜利与孙伟教授课题组在知名学术杂志Nature Communications发表题为Fiber reinforced GelMA hydrogel to induce the regeneration of corneal stroma的文章，利用生物3D打印技术，制备纤维水凝胶复合支架，在角膜基质的诱导再生领域取得重大进展。

如何制备能够模拟天然角膜基质结构的支架，同时保持角膜基质细胞的表型，诱导角膜基质的再生，是一个重大的挑战。

生物3D打印角膜支架
针对这一难题，清华大学弥胜利与孙伟教授课题组提出了使用近场静电纺丝这一生物3D打印技术制备网格状的亚微米纤维支架，后期通过水凝胶技术，制备了纤维水凝胶复合支架，用于模拟正交定向的角膜基质板层结构和板层之间起连接作用的糖蛋白。并提出了一种最优的拓扑结构及化学因子的组合，可以抑制角膜基质细胞的成纤维分化，保持其表型，并最终实现角膜基质的诱导再生。

角膜支架的材料

目前近场静电纺丝技术应用最广泛的材料是PCL，但是由于PCL是疏水材料，不利于细胞的粘附。因此该研究利用PEG作为引发剂，合成了PEG和PCL的共聚物PECL，显著的提高了PCL的亲水性。并首次利用近场静电纺丝技术成功的制备了正交定向的PECL亚微米纤维支架，角膜缘基质干细胞可以在支架表面黏附并沿着纤维方向铺展及生长。

研究通过将MA修饰到明胶大分子链上合成了GelMA，探究出最优的MA修饰度及GelMA浓度可以使封装在GelMA水凝胶内的角膜缘基质干细胞保持高的细胞活性并能铺展开。制备模具并通过灌注的方式制备了纤维水凝胶复合支架。

纤维水凝胶复合支架（图标e）

角膜支架的性能

通过研究不同纤维间距的网格状支架对纤维水凝胶复合支架理化性能的影响，找出了最优的拓扑结构可以使纤维水凝胶在力学性能、透光度和溶胀性方面最接近于天然的角膜组织。

研究将角膜缘基质干细胞接种在2D的细胞培养皿，3D的GelMA水凝胶和最优选的纤维水凝胶复合支架内，并研究角膜缘基质干细胞在含血清及不含血清的培养基中的分化及角膜基质细胞表型的维持。研究表明这种最优选的纤维水凝胶的拓扑结构及无血清培养基可以抑制角膜基质细胞向成纤维细胞分化。

最后研究使用大鼠进行角膜内的板层移植实验，分别进行了有无化学因子的3D的GelMA水凝胶和有无化学因子的最优选的纤维水凝胶支架的移植，对照组为自体角膜移植。术后通过OCT，免疫荧光染色及HE染色进行3个月的研究观察，发现相比于其他的支架，含化学因子的最优选的纤维水凝胶支架的移植可以最好的实现角膜基质的诱导再生。

今年5月，孙伟教授团队通过3D打印制造出了一种个性化的宫颈组织植入物，可以对抗人类乳头瘤病毒（HPV）。通过在锥形聚氨酯植入物的多孔结构中，加载一种抗HPV蛋白，该团队能够定量控制该蛋白的释放，并在宫颈部位附近抑制HPV的生长。

3D打印的宫颈植入物，图为清华大学的照片

HPV与宫颈癌

HPV是全球91%的宫颈癌病例的病因。每年有46万个新病例，主要的治疗方法是宫颈锥体切除术，即切除一个锥体形状的组织样本，用于诊断。如果有癌前细胞存在，该方法还可以去除癌前细胞，大部分组织会在六周内重新生长出来。然而，这种治疗方法并不是神药，因为它可能导致组织缺损，而且往往感染复发率较高。

3D打印的宫颈移植术

研究人员的目标是开发一种非破坏性的抗HPV植入物，这种植入物也可以促进结扎部位的组织生长。

首先是根据医学影像数据设计出锥形结构，然后选择的材料是FDA认证的可植入生物材料--聚氨酯，采用的3D打印技术是低温沉积（LDM）。与普通的FDM不同，LDM是在零度以下的环境中进行的，通常是在-20°C到-30°C的环境中进行，所以相分离是在打印结构内部进行的。结合冻干技术，可以在3D打印出的零件中获得多孔结构。

植入物的多孔结构，图片来源：清华大学

多孔性在这里很重要，因为它可以让研究人员在植入物中装载抗HPV "JB蛋白"。为了修改和测试不同的孔隙度，研究人员在制造过程中简单地修改了温度曲线，并实现了各种导线间距。研究小组发现，孔隙度与蛋白质负载之间呈线性负相关，但蛋白质的释放率随孔隙度的增加而增加。研究人员发现，该蛋白能有效地抑制HPV进入宿主细胞，降低了HPV作为植入部位的活性。

细胞毒性和细胞相容性试验也指出，植入物能促进细胞生长和粘附，修复愈合后的组织。在此基础上，力学测试返回的力学性能与原始宫颈组织相当--抗压模量为0.06-0.25兆帕。该结果有力地表明，3D打印技术可用于修复凝固后的宫颈组织，并抑制HPV感染的复发。

生物相容性试验中的成像，图片来源：清华大学

如果你想进一步了解生物3D打印技术的进展，3月，孙伟教授及生物3D打印领域一众大咖们在知名期刊Biofabrication上发表文章生物3D打印路线图（The Bioprinting Roadmap），从生物3D打印的各个层面提出目前现状、存在的问题与未来的可能路径。无论您想全面了解生物3D打印，还是试图探索本领域的新方向，看这一篇就够了。

IOP官方下载量已破5000，当之无愧开年最火生物3D打印综述。

点我阅读生物3D打印路线图（The Bioprinting Roadmap）

编译自：3dprintingindustry