阿卜杜拉国王科技大学开发3D打印SRS显微镜

来源：江苏激光联盟

近年来，微型显微镜的出现可为活细胞进行无标记成像，而以往许多生物成像技术需要将荧光染料添加到特定的细胞目标中。来自阿卜杜拉国王科技大学的研究人员从细长的灯塔透镜设计中汲取了灵感，开发了高NA 3D打印显微镜，可以更容易观察皮氏培养皿，并观察包括癌细胞生长在内的生物过程的分子水平细节。

▲图形摘要

受激拉曼散射(SRS)显微成像是一种无标记的化学成像技术，在生物学和医学中具有引人注目的应用，其中包括单细胞代谢、神经科学和组织组织学。凭借其固有的光学切片能力，SRS显微成像技术可以绘制样品中化学键的三维分布，其灵敏度允许对生物样品进行视频速率成像。受激拉曼散射Stimulated Raman Scattering (SRS)是1962年伍德伯里（Woodburry）和恩戈（Ng）偶然发现的。高强度的激光和物质分子发生强烈的相互作用，使散射过程具有受激发射的性质,这种散射光是拉曼散射光，所以这一种非线性光学效应称受激拉曼散射。受激拉曼散射表现出阈值特性，像激光器一样只有适当的泵功率才能产生。当分子振动由不同波长的两个激光束相干地驱动时，会发生SRS，这两个激光束在空间和时间上重叠，并且它们的光频率差异对应于分子的振动模式。在这种情况下，被驱动的相干分子振动会在两个光束之间传递能量，短波长的光束（泵浦光束）会发生强度损失（受激拉曼损耗），而长波长的光束（斯托克斯束））经历强度增加（刺激拉曼增益，SRG）。

但是，SRS显微成像的一个缺点是检测系统受到背景信号的影响，该背景信号称为交叉相位调制(cross‐phase modulation,XPM)，它是一种普遍存在的非线性现象，该信号是由激光脉冲与样品之间的强烈相互作用产生的，会产生虚假的背景信号，从而使SRS测量中的高对比度成像变得困难。为了避免SRS显微镜中与XPM相关的背景信号影响，需要使用能够收集广角光的笨重的玻璃物镜，它们通常具有毫米以下的工作距离，因此，这类镜头几乎不可能安装在用于培养活细胞进行生物成像的台式培养箱中。

在这里，研究人员介绍了一个高NA 3D打印聚光镜，该聚光镜可安装在台式培养箱中，并有效地将原本高度发散的光束引导到光电探测器。该透镜具有折反射设计，也就是说，它是由折射和反射光学元件制成的，以实现较高NA。折射元件在透镜的中心，收集光束的低发散部分，而反射元件在透镜的外部，收集光束的高发散部分。通过使用此透镜，研究人员可以在台式培养箱中测量不含XPM的SRS光谱。根据研究结果，这种3D打印显微镜头可以代替体积庞大且昂贵的高NA显微镜物镜，用于点扫描显微镜中的前向信号采集。

该高NA 3D打印SRS显微镜通过使用激光脉冲从生物样本中收集分子振动信号。并且SRS显微镜能够以实时速度生成高分辨率，无创图像的能力促使研究人员也将其部署到体内疾病诊断研究中。

▲3D打印镜头的图像（顶部）。印刷在玻璃基板上的镜头3D的光学图像（显微镜盖玻片#1,5）（底部）。镜片中央部分的SEM图像，显示菲涅耳状的中央折射部分和外部反射部分

在校准试验证实他们的新透镜可以拒绝交叉相位调制背景后，研究人员将目光投向了在传统培养皿中培养的人类癌细胞。这些实验表明，这种透镜可以以类似于传统SRS显微镜的分辨率对细胞内部组件进行成像，但方式更加方便，成本也更低。

带有不同采集光学元件的受激拉曼散射（SRS）成像。

▲图解：A，非谐振波数（2550 cm -1）的IP‐S 3D打印网格的SRS图像。0.4 NA镜头可看到与交叉相位调制（XPM）相关的强烈背景，而3D打印镜头和高NA显微镜物镜则可抑制这种情况。B，SRS图像在2950cm -1波数处，其中光聚合物拉曼光谱具有峰值。C，HepG2癌细胞在2850 cm -1的SRS图像，突出显示了细胞中的脂质滴。用3D打印透镜抑制XPM伪像可与高NA显微镜物镜相媲美。用1.27 NA显微镜物镜激发

本文一作Bertoncini表示，通常用来收集SRS显微镜信号的物镜要花费数千美元，现在我们有一个具有类似功能的镜头而且这个价格用不到之前的十分之一来生产。

本文来源：Andrea Bertoncini et al, 3D ‐Printed high‐NA catadioptric thin lens for suppression of XPM background in Stimulated Raman Scattering microscopy, Journal of Biophotonics(2020). DOI: 10.1002/jbio.202000219