AM 细胞外基质增强型生物墨水用于人体组织的3D打印

来源： EngineeringForLife

3D生物打印技术主要是用生物材料和活体细胞，模拟体内器官结构，通过3D打印的形式将器官打印出来，该技术有望成为未来器官移植的重要手段。但迄今为止，3D生物打印的研究大多局限于构造结构简单的组织，如皮肤和心肌补片。目前，研究人员已经探索了几种提高生物墨水生物活性的技术，如结合特定配体及对材料表面进行功能化修饰以增强细胞粘附或血管生成等。然而，这些手段通常专注于增强组织发育某一阶段的生物活性(例如，细胞粘附或促血管形成等)。

脱细胞化细胞外基质(dECM)来源于天然组织，是一种潜在的具有组织特异性成分的生物墨水。然而细胞外基质较差的凝胶动力学特性限制了其3D生物打印的精度，为了克服单一细胞外基质生物墨水的局限性，瑞典隆德大学瓦伦堡分子医学中心Nathaniel S.Hwang研究团队在Advanced Materials上发表题为“Extracellular-Matrix-Reinforced Bioinks for 3D Bioprinting Human Tissue”的文章。研究者制备了一种组织特异性复合生物墨水，它由天然聚合物海藻酸盐组成，并用脱细胞化的细胞外基质（dECM）增强生物活性，该复合生物墨水可用于构建具有一定尺度的无需外部支撑结构的可灌注管状和分支结构。此外，该复合生物墨水中的ECM增强了3D生物打印过程中原代人祖细胞的存活，支持组织特异性细胞分化，并在体内刺激植入物的全层血管化，同时最大限度地减少异体反应。

由于ECM组分的自发自组装，从胃蛋白酶消化脱细胞组织得到的ECM溶液在37°C时可形成凝胶，因此需要一个支撑结构来使用3D打印形成更复杂的几何形状。海藻酸钠对哺乳类动物细胞是无毒且具备生物惰性的，研究者通选用海藻酸钠通过微相分离制备得到具有互穿网络结构、相分离的复合ECM衍生水凝胶（rECM）。通过分别对ECM和海藻酸钠进行荧光标记，研究者发现ECM组分均匀分布于凝胶块体中，且保留了微观的相分离结构。对比海藻酸钠水凝胶，ECM复合的水凝胶增强了剪切应力下的机械强度。细胞生物学评价表明小鼠肺上皮细胞（MLE12）及人肺上皮细胞（A549）均能在海藻酸钠凝胶和ECM复合水凝胶中实现良好的增殖效果，通过5-乙炔-2′-脱氧尿苷（EdU）染色，探究rECM水凝胶中MLE12的增殖情况，流式细胞术检测数据表明ECM成分具有较高的生物活性并能诱导其增殖（图1）。

图1 rECM复合水凝胶的力学及细胞相容性表征

促血管生成的3D打印结构有利于移植物的长期存活，研究者利用鸡胚绒毛尿囊膜实验评价凝胶的体外成血管能力，研究发现，相比基底膜提取物（BME）组，rECM凝胶组明显促进了新血管生成。体内凝胶的皮下植入试验结果表明，rECM复合水凝胶减少了促炎症M1巨噬细胞的增加，也表明了抑制M1表型对组织再生的重要性，且rECM水凝胶支架中含有完整的新生血管网络（图2）。

图2 rECM复合水凝胶的血管生成性能表征

为了验证rECM生物墨水是否具有生成生物组织的潜能，研究者测试了来自肺组织ECM的rECM复合水凝胶是否能够支持从正常人呼吸道分离的原代上皮祖细胞的生长和分化。研究者将人类支气管上皮细胞（HBECs）接种于凝胶表面，培养7天形成单层细胞层，之后提起至气液界面，模拟体内的组织环境，孵育培养一个月。荧光染色表明细胞粘附生长于凝胶表明，形成多层上皮层，且上皮细胞保留了基底祖细胞表型标志物的表达。在证实了人类rECM生物墨水具有优异的流变学和生物学属性后，研究者测试了其3D生物打印亚段支气管的能力，亚段支气管直径约为4mm，由外平滑肌层和内上皮层组成。所打印的支气管结构包含三层细胞，内层是HBECs细胞层，外部两层是人肺平滑肌细胞（HLSMCs）细胞层。经过7天的培养基液体环境中培养和气-液界面环境下的28天孵育后，3D生物打印人体气管的内腔均保持开放状态，没有明显的尺寸变化，这表明该结构的稳定时间至少可达28天。

图3 rECM复合水凝胶用于呼吸道组织的构建

综上所述，复合ECM组分，研究者通过微相分离产生了dECM增强性的的组织特异性rECM水凝胶，该类生物墨水能在体外3D生物打印出人类呼吸道上皮祖细胞和平滑肌细胞组成的气管空腔结构。该研究为下一代组织特异性生物墨水的研发奠定了基础，并使3D生物打印组织应用于临床移植成为可能。