基于糖牺牲材料的激光烧结技术制备树突状血管网络组织模型

来源： 生物打印与再生工程

人体的新陈代谢功能是通过复杂的、分级三维（3D）血管网络输送氧气和营养物质以及清除废物来维持的。分级血管网络最大限度地增加了代谢物扩散的表面积，同时也最大限度地减少了流体对流的阻力。因此，通过工程化手段体外构建分层血管网络是体外重构组织器官的基础。

近日，美国莱斯大学Jordan S. Miller团队在Nature Biomedical Engineering期刊发表题为“Generation of Model Tissues with Dendritic Vascular Networks via Sacrificial Laser-sintered Carbohydrate Templates”的文章，报道了使用糖粉牺牲材料结合激光烧结技术制造树突状网络支架，然后灌注载细胞水凝胶构建树突状血管网络组织模型。这项研究证明树突血管网络可以维持超过1cm厚的组织模型中细胞代谢活性，为研究血管网络结构、代谢物转运和组织功能之间的关系提供了新的模型策略。

背景介绍

血管网络是人体的重要组成部分，保证组织器官的营养和氧气的供应。较早的研究采用软光刻和插针管的方式构建血管通道，随着工程技术的发展和新材料的出现而逐渐淘汰，目前的研究手段聚焦于增材制造在血管化模型构建中的应用。构建给定的血管化通道可以通过喷墨、挤出工艺，悬浮打印工艺，立体光刻工艺，激光烧结等技术实现。其中激光烧结技术指以激光为热源对粉末压坯进行烧结的技术，具有成型速度快、精度高等优势，非常适合构建复杂血管通道。Jordan S. Miller团队模拟生理状态下血管分支结构，利用激光烧结技术将糖粉材料烧结成复杂网络的糖支架。然后用水凝胶包裹糖支架，在给定条件下溶解该支架形成空腔，最后在空腔内灌注血管内皮细胞形成完整的树突状血管网模型。利用烧结技术可以构建诸如分层网络等复杂的拓扑结构，既为体外长期培养大尺度组织模型提供新的解决方案，也为研究血管网络结构在组织代谢中的功能提供可能。


实验结果
1.   基于糖牺牲材料的激光烧结技术流程
实验中使用的是糖牺牲材料的基础成分是异麦芽粉（Isomalt powder），但是异麦芽粉与标准激光烧结材料（如尼龙）相比具有更高的粘性（图1d），需混合抗凝结剂（二氧化硅，玉米淀粉和黄原胶）以稀释其粘性。然后糖粉末由粉末分装器和振动筛槽均匀地喷洒在指定区域，通过激光烧结构筑成型（图1a）。所构建的糖支架具有异质3D分支，曲率光滑和无支撑几何体的特性（图1b）。该支架同时具有一定的硬度和脆性，其弹性模量约为600MPa，足以支撑其自身重量并完成后续的水凝胶灌注。该团队还更新了OpenSLS的硬件和固件，使其能编码区域特定的烧结参数，更适合进行糖粉的激光烧结（图1e）。

2.   基于糖牺牲材料的激光烧结技术后处理和特性表征
烧结后的糖支架表面颗粒感强，使用浓缩异麦芽糖溶液处理后可以快速抹平表面而不会影响整个结构（图1f）。接下来，该团队评估了激光参数和几何结构之间关系。实验结果总结了从厘米（图1b，图1c）到百微米（图1g）范围内的糖支架制造参数。尤其糖丝直径在400 -800微米范围内，固定功率密度为45Wmm−2时，激光移动速度和糖丝直径之间存在近似线性关系（图1g，图1h）。

图1. 基于激光烧结技术的糖支架设备搭建和制作流程。

3.   基于激光烧结技术的糖支架牺牲性检测
为验证烧结并光滑处理后的糖材料具有牺牲性，该团队通过烧结制作简单的网格结构，然后用不同的材料包裹网格结构。在外壳材料凝固后，加水或者PBS溶解糖材料。结果表明，糖材料可被PDMS、PCL、PEGDA、琼脂、丝素蛋白、纤维蛋白等多种材料或水凝胶包裹，并且溶解后的管道均有良好的连通性（图2a - 图2c）。然后该团队制造尝试构建复杂的拓扑结构，在可控性较差的琼脂材料中分别成功构建了二维多通道、三维分层通道和三维独立通道等复杂结构。以上实验说明了基于糖粉末的激光烧结技术具有在多种水凝胶中构建复杂血管通道的可能。

图2. 烧结后糖支架在分支网络和多血管网络结构中的牺牲性检测。

4.    树突状血管网设计
为模拟生理条件下的动脉-静脉血管网络，该团队采用了叶脉分支模型来计算分支血管拓扑结构。简言之，在一个椭圆模型内假定两个叶脉生长点并假定其随机延伸（图3a），当两个生长束接近时，它们的末端分支相互吸引（图3b）并会聚形成闭合网络（图3c）。但是网络管道厚度的计算遵从Murray定律而独立于叶脉网络生长步骤（图3d）。经过对该网络的流动性评估后发现，该网络可以有效地将流量分布在所有通道中（图3e），即分叉的流体在分支中呈现出较低的速度，而会聚的流体获得速度则是分支速度之和（图3f）。另外，研究结果表明通道中的最大速度和壁面剪应力是一致的，证明了整个网络中的流体流动是均匀分布的（图3g）。该团队还发现通过标准计算流体力学（CFD）可模拟上述流动性评估结果，于是提出了将CFD用于模拟和预测血管流动性的可能。文章作者最后通过检查三个单独的粒子图像测速（PIV）实验，证明了该网络构建的可重复性（图3i，图3j）。

图3. 基于叶脉分支模型的树突状血管网络模拟。

5.    激光烧结糖支架血管网络载细胞培养
在获得稳定构建血管网状结构的工艺参数后，该团队开始进行载细胞实验。血管网外层水凝胶中混有被mOrange标记的IMR-90成纤维细胞，血管通道内皮通过灌注种植GFP标记的内皮细胞（HUVEC）。经过11天的灌注培养后，结果发现HUVEC在管腔内长势良好，并有向水凝胶内萌发的趋势。进一步的评估表明，HUVEC均匀地覆盖在网络的各个分支（图4c，图4d）和通道的整个周长（图4e）周围。接下来，该团队在同一个血管网糖支架上的不同区域用不同的水凝胶包裹，构建出一个液体互通的异源材料血管网组织模型，证明了糖支架激光烧结技术在构建不同组织交界面模型的潜力（图4f）。

图4. 糖支架血管网络具有良好的细胞培养活性。

6.    载细胞水凝胶中细胞代谢的区域异质性
为深入了解灌注水凝胶中不同细胞密度下的代谢活性，该团队通过激光烧结技术制造单管道水凝胶（图5a）。水凝胶中混合不同密度的HepG2肝细胞，在第0天、第3天、第7天后通过MTT染色研究细胞代谢活性。结果发现，靠近单管道的细胞一直维持较高的代谢活性而其他区域的代谢活性从第3天开始减弱（图5b，c）。对低细胞密度水凝胶的研究显示，从第3天开始管道附近的细胞密度、代谢活性（图5d，图5e）开始加速上升，而高细胞密度水凝胶中第3天和第7天的细胞密度没有显著变化，可能原因是水凝胶中细胞密度过高而很快达到饱和。同时第7天的结果还表明，在不同细胞密度的水凝胶中其代谢活性半径和总代谢水平随着时间的推移趋于相同（图5f，图5g），并总结了细胞活性与通道距离之间的简单函数关系（图5h）。

图5. 载细胞水凝胶中细胞代谢活性评估。

7.    载细胞水凝胶树突状血管网灌注培养研究
该团队同样通过烧结技术构建树突状血管网支架并包埋于2%琼脂糖胶中，并验证了该结构的通道流动性（图6a – 图6d）。然后，将该支架包埋于载HepG2细胞的水凝胶中，观察到3天后树突状网络周围细胞代谢活性增强（图6e）。该团队进一步开发了一个图像处理工作流程，将整个凝胶的代谢活动进行可视化，并发现树突状血管网存在灌注不充分的区域。其可能原因是该区域上游管道本身灌注不足导致的（图6f – 图6h）。

图6. 树突状血管网络的制备、灌注和载细胞培养分析。

8.    树突状血管网络灌注培养支持原代肝细胞维持代谢活性
首先，该团队制作简单的多通道水凝胶，水凝胶中植入小鼠原代肝细胞。相比于静态培养，通过灌注培养的原代肝细胞维持更高的代谢活性和更真实的蛋白表达，细胞之间的间隙也更为紧密，同时也表达更高的白蛋白水平（图7a-图7g）。然后，该团队制作了1.5cmx 3.8cm大尺度树突状网络培养小鼠原代肝细胞（图h）。结果发现肝细胞主要聚集在管道周围生长（图7i，图7j），这些细胞在培养7天后细胞仍然维持白蛋白分泌功能和紧密的团簇结构（图7l – 图7n）。进一步分析发现该团簇代谢活性在培养3天达到最高，培养7天后出现明显下降。同时E-cadherin表达检测也证实了代谢的变化（图7j，图7k）。

图7. 树突状血管网络灌注支持原代肝细胞体外培养。

结论
在这项研究中，Jordan S.Miller团队证明了通过激光烧结制作的糖支架可被用于构建复杂的通道网络用于模拟人体的血管系统。该技术采用牺牲材料灌注的方法构建水凝胶结构，使得体外构建任意血管拓扑结构成为可能。激光烧结技术克服了挤压技术在复杂结构和多层结构上的制造限制，从而实现具有仿生功能的三维分级、分支血管网络。

Generationof model tissues with dendritic vascular networks via sacrificiallaser-sintered carbohydrate templates[J]. Nature Biomedical Engineering, 2020:1-17.

DOI：10.1038/s41551-020-0566-1