中山大学郭双壮等《Adv.Sci.》:冰与光之歌，冷冻打印+激光融化实现大尺寸细胞冻存！

来源： 高分子科学前沿

干细胞疗法可以为癌症、帕金森病、受损脊柱神经、糖尿病等诸多疾病的治疗带来革命性的改变，但其中关键的一步是细胞制品的高通量冷冻保存，并在使用前快速高效复苏。而传统较慢的冷冻方法会引起细胞内外水的结晶，从而对细胞器和遗传物质带来无法修复的损伤。这就需要添加较多的冷冻保护剂（CPA）或保存小尺寸的样品来提高细胞存活率。同时，传统的水浴复苏法在处理大尺寸干细胞冻存样品时也会因传热缓慢而损伤细胞。因此，如何高通量、高存活率地冻存和复苏干细胞成为制约相关制品应用的瓶颈之一。

中山大学的郭双壮副教授和美国明尼苏达大学John Bischof教授团队合作，开发了液氮温度下的大液滴冷冻打印技术和激光引发的等离体激元加热融化技术，并分别应用于大尺寸干细胞样品的冻存和复苏，整个过程细胞存活率高达90%以上。该研究内容以 "Conduction Cooling and Plasmonic Heating Dramatically Increase Droplet Vitrification Volumes for Cell Cryopreservation" 为题发表在《Advanced Science》上。

图 1. 大液滴玻璃化冷冻打印和激光解冻示意图

大尺寸液滴冷冻打印
计算机控制的3D打印墨水分配系统，可以通过调节压力和时间很灵活地控制液滴的大小和位置，为自动化高通量冷冻保存提供了支持。液滴冷冻打印的目标是使液滴尽可能快速地从室温冷却到零下140 ℃以下，水分子来不及结晶而以玻璃态保存，这就需要在CPA尽量少用的情况下提高液氮和液滴之间的热量传递速度。直接将液滴打印到液氮中会因为氮气的包裹浮在液面，同时氮气层也阻碍了液滴中热量的传递，降低了冷却速度而使水结晶成冰。

作者采用浮在液氮表面的铜箔作为载体，在液氮沸点温度（-196 ℃）附近的环境中将液滴打印在铜箔表面（如图1所示）。这种方法一方面使得液滴以较大接触面与铜箔以热传导方式发生快速热量交换，同时表面与超冷空气以自然对流方式传热，二者共同作用下液滴的冷却速率高达 104 ℃/min （如图2所示）。 随着液滴体积的变大，顶部冷却速率迅速下降，同时内部热应力的积累还会导致液滴的破碎，综合CPA浓度和冷却速度等因素的影响，4微升液滴具有较为平衡的玻璃化能力。

图 2. 液滴冷却速率表征。A-C）在打印液滴的顶部、中部和底部放置热电偶用于测量温度实时变化（比例尺=1 mm）。D） 不同位置的温度变化曲线。E）不同位置平均冷却速率。

激光等离体激元加热
除了快速冷冻，加热复苏也是细胞制品冻存过程的重要环节，而传统水浴复苏法是一种对流热传递过程，在升温后期会存在明显的去玻璃化现象，同时随着液滴体积的增大，内部升温速率会迅速减小到103 ℃/min。本研究中，在CPA溶液加入生物相容性良好的金纳米棒（GNR），在波长为1064 nm激光作用下通过等离子体激元效应将光能转化为热能，再将热能迅速传递到周围处于玻璃态的液滴并使其融化（如图3所示）。

通过精确调节GNR浓度、激光强度和脉冲时间，可以避免液滴在加热过程中出现过冷或过热现象对细胞的损害。这样通过无数纳米颗粒多点加热的方式可以使得冻存的玻璃态液滴以高达 106 ℃/min的升温速率被复苏。同时随着液滴体积的增大，由于透镜折射作用而引发的分层现象更加明显（图3G）。外层液滴无法经激光直接加热，需要经内部液滴热传导加热而融化，从而形成一个较冷的外壳。对于超过16 微升的液滴来说，由于外壳较厚会发生重新结冰现象，对细胞的存活产生较大影响。经过系列过程参数优化，含有干细胞的4微升液滴经过冷冻打印-激光复苏整个流程处理之后，干细胞的存活率可达90.4%。冷冻的液滴在液氮中保存三个月再重新经激光复苏，细胞存活率没有明显下降。

综上所述，作者及研究团队将冷冻打印和激光加热相结合，可以获得超高的冷却和升温速率，从而实现大液滴（4微升）、低CPA浓度、高存活率地冻存干细胞。整个过程都可以进一步由自动化程序控制，从而为高通量、高效率冻存生物制品提供了一条可靠的技术路径。未来该技术可适用于其他细胞类型，为血液病、癌症患者等需要进行细胞治疗的人群带来福音。

图 3. 玻璃化液滴加热复苏过程表征。A）高速相机记录的激光加热过程。B）传统水浴加热过程。C）等离子激元加热原理示意图。D-E）GNR浓度对温度非均一性、能量吸收率的影响。F）不同液滴大小和GNR浓度与能量吸收率之间的关系。G）不同大小液滴在激光加热过程中的照片和升温速率分布模拟结果。H）不同液滴大小在激光加热和水浴加热过程中的升温速率变化。I）不同液滴内部超过临界升温速率体积分布。比例尺=1 mm。

占利博士和郭双壮副教授为该论文的第一作者，John Bischof教授为该论文的通讯作者。

原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202004605