Nature 子刊：高密度细胞球悬浮3D打印构建异质组织

来源： EngineeringForLife

我们需要细胞模型在体外研究人类发育和疾病，以及筛选药物的毒性和功效。目前的研究方法在功能化组织模型的构建方面受到限制，这样的模型需满足必要的细胞密度和异质性，以适当地模拟细胞和组织行为。在此，研究者开发了一种生物打印方法，以高分辨率将球体转移到自愈合支撑水凝胶中，从而使其图案化并按预先设定的空间位置融合到高细胞密度的微组织中。研究者生物打印了诱导多功能干细胞来源的心脏微组织模型，该微组织有着空间上可控、且成比例的心肌细胞和成纤维细胞，以模拟心肌梗死后引发的疤痕性心脏组织的结构和功能特性，包括收缩力减弱和不规律的电活动。生物打印体外模型与功能读数相结合，以探究各种促再生microRNA治疗方案如何影响由心肌细胞增殖带来的组织再生和功能恢复。该方法适用于一系列生物医学应用，包括开发精确模型来模拟疾病和筛选药物，尤其是在高细胞密度和异质性很重要的情况下。

相关研究以题为“3D bioprinting of high cell-density heterogeneous tissue models through spheroid fusion within self-healing hydrogels”发表于“Nature Communications”杂志，宾夕法尼亚大学的Jason A.Burdick教授为通讯作者，Andrew C. Daly为第一作者。

为了能实现球体的图案化，研究者开发了一种在自愈合水凝胶中生物打印球体的方法：1. 真空抽吸介质储器中的球状体；2. 将球体直接转移至有剪切变稀特性的支撑水凝胶中；3. 由真空去除和水凝胶自愈合，将球体沉积到任意位置，如图1a所示。这一过程是通过在两个容器之间的用于球体输送的狭窄通道将包含球体的培养基容器与包含支撑水凝胶的第二容器分离，如Movie 1所示。该方法避免了在液体和空气界面之间转移细胞和球体时，表面张力效应会显著降低细胞活力。支撑浴水凝胶由用金刚烷或β-环糊精修饰的透明质酸组成，具有剪切变稀和自愈合的特性，在高应变到低应变的循环过程中，随着剪切速率的增加，水凝胶粘度降低，存储模量恢复，如图1b所示。

图1 自愈合支撑水凝胶中的生物3D打印球体

如图2所示，研究者探讨了水凝胶的流变性能对生物打印精度的影响。将聚合物浓度从3 wt%增加到7 wt%会产生具有更高存储模量的水凝胶，这需要更高的应变来引发屈服。研究者进而评估了两种球体尺寸的生物打印的精度（直径分别为200和400μm）。对于XY轴精度，测量了所有聚合物浓度下球体直径的~8–15％的漂移距离。对于Z轴精度，测量了所有聚合物浓度下相似的球体直径~10–15％的漂移距离。这些漂移可通过在椭球体平移期间(在椭球体左侧)的水凝胶位移的荧光映射来可视化。通常这些距离很小，表明生物打印球体的精度很高，并支持将球体的高分辨率图案化。打印后24小时内球体中细胞的活力也得到了评估。在较低的聚合物浓度(3和5 wt%)时，细胞活力高(~90-95%)，而在最高聚合物浓度(7 wt%)时，细胞活力显著下降(~87%)。较低的聚合物浓度可能会减少球体平移过程中剪切力的影响，从而提高细胞的存活率。由于在所有聚合物浓度下生物打印精度都高，且在低聚合物浓度下细胞存活率最高，我们在
所有后续研究中都使用了3 wt%的水凝胶。

图2 支撑水凝胶流变性和生物3D打印精度

如图3所示，研究者接下来探讨了定向球体融合是否可用于制造结构受控的多球体微组织。当球体通过直接接触进行生物印记时，在培养的四天中观察到融合。此外，当以50μm的分离距离对球体进行生物打印时，观察到可比较的融合水平。这些距离在作者方法测得的精度范围内，从而最大程度地减少了球体可以以足够接近球体融合的方式进行生物打印的担忧。利用这些特性，接下来将8个球状体沉积成环形，从而在培养4天后使其连续融合成微组织环。可以用多层球体重复此过程，以形成微组织管。重要的是，由于支撑水凝胶中交联的非共价和可逆性质以及柔软的水凝胶机械性能，因此可以吸去支撑水凝胶以从融合的微组织中去除。

图3 通过定向球体融合生物3D打印微组织

如图4所示，研究者使用球体生物打印方法设计了局灶性心脏纤维化的简化模型。为了模拟健康和纤维化的心脏组织，将iPSC衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）和人心脏成纤维细胞（CFs）的配成不同比率（“健康”模型 iPSC-CM：CFs=4：1；“疤痕”模型 iPSC-CM：CFs=1：4），这通过对心脏肌钙蛋白T（cTnT）（CM marker）和波形蛋白（CF marker）的免疫荧光染色进行了验证。接下来作者进行了收缩记录并使用开源的肌肉运动软件来确定收缩幅度（与收缩力相关）和峰到峰值时间（心跳率或节奏）。与3天的疤痕对照组相比，健康的球体的收缩幅度显着增加，并且趋向于更快的峰间时间~850ms（~70 bpm）。光学映射细胞内Ca 2+显示健康球体中的Ca 2+通量稳定且同步，而在疤痕球体中仅观察到较低水平的Ca 2+通量，且分散而零星分布。量化了心脏细胞周期的关键参数，包括钙瞬变持续时间（CTD）（ms），峰到峰值时间（ms）和钙通量幅度（F/Fo）。健康球体的CTD和钙通量振幅显着较高，健康球体的峰值时间显着降低（即更快的去极化）。总之，这些结果表明，心脏球体中CM：CF
比率的变化证明了构建健康和疤痕心脏组织模型的可行性。

图4 制造心脏球体用于疾病模型应用

通过健康和疤痕球体的定向融合来创建心脏组织的异质环，可模拟局灶性心脏纤维化。环形结构用于模拟心腔的组织水平电生理特性，包括再次出现心律不齐的可能性。为了对健康的心肌建模，对直接接触的8个健康球体的环进行了生物打印，而对有疤痕的心肌模型进行了7个健康球体和1个瘢痕性球体的环的生物打印，如图5所示。培养5天后，对cTnT和波形蛋白双重染色证实了相邻球体之间的融合，并且在疤痕微组织中观察到了高成纤维细胞密度的区域。活死染色显示融合5天后具有高细胞活力，并且iPSC-CM与CF的比例在培养期间保持不变。在微组织的健康区域也观察到了健壮的肌节染色，在疤痕区域观察到了较低的水平。另外，连接蛋白-43在细胞边界处的染色表明在微组织的健康区域中间隙连接的形成，而在疤痕区域中发现的染色水平较低。微组织环也以连续和同步的方式收缩，从支持水凝胶中取出后可以观察到。微组织收缩的定量揭示了与健康对照组相比，疤痕微组织收缩幅度减小的趋势，模仿了心肌梗死后整体收缩力的降低。

图5 生物3D打印心脏微组织用于疾病模型应用

如图6所示，作者用疤痕心脏球体筛选了一系列miRNA治疗持续时间（0、0–2、0–4和0–7天）。为了评估miRNA处理的瞬时效果，在第2、4和7天进行了顺序收缩成像。与未治疗的对照组相比，在相同的时间点，连续治疗4天和7天观察到的收缩幅度明显增加。值得注意的是，在这些情况下，收缩值增加了大约三倍，并达到了健康球体中收缩幅度的~20％。当培养基中仍存在miRNA时，收缩速度也比对照组显着提高（快2倍）（4天0-4天治疗，7天0-7天治疗）。为了确定miRNA处理是否能促进瘢痕状球体中CM和CF的增殖，研究者在7天时进行了EdU标记（一种增殖标记）以及cTnT和波形蛋白染色的共染色。存在cTnT+EdU+岛，表明增殖和克隆扩增，尤其是治疗时间较长（0-4天，0-7天）的情况。没有观察到Edu+细胞的数量增加，表明miRNA处理主要影响CM增殖。在健康的球体中也观察到类似的趋势，随着cTnT数量的增加与对照组相比，在所有治疗条件下均观察到Edu+细胞，对CF增殖的影响有限。

图6 评估miRNA对心脏微组织行为的影响

论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-021-21029-2