多室水凝胶纤维诱导细胞组织定向

来源：EngineeringForLife

大多数组织中的细胞在空间分布和排列上都表现出高度的组织性，这种有组织的结构对于成熟过程中细胞的正常发育和成熟组织的功能至关重要。因此，用于组织工程应用的生物制造细胞支架折叠需要模仿这种细胞结构，以复制自然组织的行为。在组织工程支架的制造中，将具有细胞大小分辨率的理化线索融入三维支架中以引导所需的细胞组织则仍十分具有挑战性。University of Connecticut Health Center的Ali Tamayol课题组在Applied Physics Reviews上发表了题为“Controlling cellular organization in bioprinting through designed 3D microcompartmentalization”的论文，研究报道了一种快速、简单和经济有效的方法，用于连续打印具有内在三维微丝的多室水凝胶纤维，以控制细胞取向。这种策略可以很容易地应用于各种基于纤维的组织工程方法，包括3D生物打印和生物编织品制造，控制细胞组织，促进更多仿生结构的生物制造。

多室水凝胶纤维的制备工艺如图1，打印喷头主要是将静态混合器集成到同轴挤出装置中，用于打印具有图形化内部微形貌的海藻酸/ GelMA水凝胶纤维。海藻酸、GelMA两相水凝胶在静待混合器的多次分割下形成互相隔离的微纤维结构，然后通过同轴微流控装置的内部通道挤压，并接触钙离子，形成藻酸盐凝胶以及UV光固化来稳定结构。在设计的微结构中，GelMA部分提供了有利于细胞的环境，而海藻酸提供了形态和机械支撑，引导细胞的方向。结果表明，微形貌的组织和细胞排列，可以通过控制打印过程中的流动参数来定制。尽管宏观纤维的直径大于1mm，但精确调整的内部微形貌成功诱导了细胞扩散和对齐，这有助于细胞快速增殖和分化向成熟的生物结构。

图1 多室水凝胶纤维制造原理示意图

静态混合器与各阶段的水凝胶纤维横截面如图2，静态混合器由多个螺旋元件组成，在不同的方向上间歇扭转，用于形成多螺旋结构。如模拟所示，该装置中的每个混合元件将混合流体切割成两个子流。通过向混合器中注入两种不同的溶液，流体被连续地分成更多的子流，形成不同条纹的阵列。并且可以通过控制静态混合器中元件的数量，可以形成厚度和条纹数量可调的内部结构。同轴的通道结构，则可以通过调节内外两相液体的流速比例，准确控制最终纤维尺寸。

图2 多室水凝胶纤维相关表征

为验证该纤维结构对形成细胞定向组织的影响，研究比较了在多室凝胶纤维中与在用预混合生物墨水制作的纤维中培养的成肌细胞的行为。尽管纤维的直径(>1mm)比细胞大小大，但24小时后在多室凝胶纤维中观察到高度对齐的细胞组织，而预混纤维包裹的细胞几乎保持球形，如图3。该结果可以通过以下方式来解释：（1）细胞在藻酸盐切片上和GelMA微丝中不同的扩散倾向；（2）纤维内部微结构作为指导细胞排列的拓扑线索；（3）由于GelMA和藻酸盐切片中的支架刚度差异，细胞受到不同机械刺激。

在细胞活性方面，GelMA区域的存在确保了细胞的扩散和增殖。而在预混合凝胶结构中，海藻酸盐的存在导致支架无法降解，因此不能提供足够的空间进行细胞的扩散和增殖。随着时间的推移，细胞的活性和增殖速度低于多室水凝胶纤维中的结果。

图3 多室水凝胶纤维的细胞组织和代谢活性

通过设置不同的同轴流速比，可以调整细胞取向与纤维轴向的角度，如图4。随着流速比例的变化，可以对纤维内的细胞组织结构进行实时控制。

图4 多室水凝胶纤维内细胞组织取向的实时控制

基于纤维的生物制造方法可用于制造各向异性组织（如肌肉）的仿生支架。在生物工程支架中模拟这类组织的纤维结构可以调节被包裹的细胞的行为以增强肌生成。为证明这个概念，研究验证了所提出的支持成肌细胞成熟的策略，如图5。肌细胞迅速增殖、融合并形成多核肌管。在包封后第7天，水凝胶纤维被高度定向的密集排列的肌管完全占据，形成一个束状结构。多室水凝胶纤维中成肌标志物的表达也表明细胞分化成熟并形成肌纤维。

图5 多室水凝胶纤维作为肌肉组织工程支架的应用前景

本研究中的多室水凝胶纤维最重要的优点之一是与现有的基于纤维的生物制造方法相容，可用于构建具有生理尺寸的更大结构。图6表明了纤维具有（1）打印多层网状、单向结构；（2）各类编织结构；（3）细胞负载的编织与绳结结构的能力。

图6 多室水凝胶纤维在生物制造中的应用

总结，本文利用静态混合器与同轴打印相结合，制造多室水凝胶纤维的具有沿纤维轴向的内部微丝，为改进对天然肌肉组织的模拟和诱导成肌细胞对齐提供了机会。该生物制造策略简单而稳健，且可以很容易地与任何挤压生物打印或纤维纺丝装置集成，以制造能够控制细胞排列的多室支架。