光固化生物3D打印教程之高精度水凝胶支架制造

来源：EFL

投影式光固化生物打印(Projection-based 3D bioprinting, PBP)具有精度高、速度快、自支撑等优势，近年来在生物制造领域有越来越多PBP的成功应用案例。然而，完全理解PBP的原理需要光学、高分子、工程、生物学等综合学科的背景知识，初学者熟练掌握PBP的流程也需要经历长时间的试错与经验积累。降低PBP的入门使用门槛，可使更多研究者能从这项技术中受益。

近期，EFL团队基于其多年相关经验，在Bio-Design and Manufacturing杂志上发表题为“Projection-based 3D bioprinting for hydrogel scaffold manufacturing”Technical note，给出了一个标准的水凝胶支架打印流程，我们将PBP生物支架打印分为了“材料配制”、“支架打印”、“后处理”与“细胞接种”四个工序，给出了标准化的操作方法，整理了很多常见的问题、技巧及背后机制。通过这篇教程，希望能够帮助PBP初学者，降低非工程学科背景使用者在工艺测试上的时间和成本，将PBP作为得力工具加速其研究。论文一作为孙元博士生，通讯作者为贺永教授。

【PBP工作流程】

图1 PBP操作流程图（以EFL-8601打印机为例说明）

1. 材料配制：

介绍用于投影式光固化打印的GelMA光敏水凝胶的组成成分、配比、配制方法、储存方法、各成分打的功能机理。与常规三维细胞培养不同的是在材料中添加了可以降低打印误差的吸光剂。除标准化流程外，特别强调了两个实用的小技巧：先使用冷溶剂润湿各成分后再加热溶解，以及通过离心方法除去溶解后产生的大量微气泡能够显著提升打印质量。

2. 支架打印：

因为相关打印设备的商业化，打印过程的设置已变得非常简便，而打印参数设置通常软件里也配有推荐值，初学者可根据软件提示一键打印。然而作者重点提示了两个打印过程中常见的问题：模型摆放方向与打印件脱落，阐释了打印时间、x-y平面与z方向制造精度差异与模型摆放方向间的关系，介绍了采用打印原液对平台涂底的防脱落实用技巧。

3. 后处理：

后处理是很多熟悉PBP的研究者都容易忽略的过程，科学的后处理不仅可以大大延长支架的储存时间，而且能提升成品精细结构精度与细胞粘附能力。后处理包括：清除剩余的未交联材料、消毒、生物因子处理、冻干等标准步骤。

4. 细胞接种：

与传统培养皿或孔板中平面接种细胞不同，PBP打印的水凝胶支架通常具有复杂的三维形貌，为复杂的曲面接种细胞通常需要多角度多次接种。文中以空心管状结构为例，介绍了如何将内腔铺满细胞的标准化操作方法与其背后的原理。

【实验案例】

图2 管状支架应用案例

管状结构广泛存在于生物体内，如血管、髓鞘、胆管等。作者按PBP标准流程进行操作，并给出了各环节的具体参数。通过PBP打印支架再接种的方法能够制造出含有单层均匀布满内腔的内皮细胞层血管模型。

【讨论：载细胞打印 vs 支架接种细胞】

如今载细胞打印技术也已非常成熟，为什么我们还需要先制造支架再进行接种的分步方案？作者给出了以下两点重要理由：

1. 空间分离避免成形性与生物性的矛盾：

生物材料需要兼具生物性能与成形性能，但这两者通常是矛盾的，优异的生物性能需要多孔疏松的材料来降低对细胞的约束，提升物质的交换，这势必会降低交联过程中交联基团间发生反应的概率，降低成形性。这是细胞处于水凝胶内部三维包裹时的情况，即载细胞打印时无法避免的问题。然而，支架打印剥离了制造与细胞培养的过程，制造过程中无细胞，接种过程中细胞实际以二维铺展状态粘附在三维支架表面。两个过程不再彼此制约，从而可以制造出更加复杂的支架结构用于搭载细胞。

2. 时间分离降低复杂度便于交叉合作：

载细胞打印时，必须同时满足材料、制造、细胞等前提条件，受到细胞活性的限制，整个过程必须在短时间内完成。从研究者的实验角度考虑，这需要完整的材料、工程、生物因素同时在场，无疑在无形中大大提升了门槛。而支架打印完全可以提前做好支架并冻干保存，然后待细胞状态合适时再进行接种。这降低了完整流程的复杂度、提升了成功率、也方便不同学科间的交叉合作。

文章来源：https://doi.org/10.1007/s42242-022-00189-0