浙江大学&牛津大学团队：一种用于多交联方式多材料嵌入式打印的支持浴

来源： EngineeringForLife

嵌入式生物三维打印技术将二维打印平台转移到三维支持浴中，以三维支持浴向打印的材料提供支撑，消除了传统挤出式生物3D打印对生物墨水机械性能的要求，由此解决了生物墨水可打印性和生物相容性之间的矛盾。然而，现有的支持浴在打印窗口、与生物墨水或交联剂的兼容性以及支持浴的去除等方面存在局限性，极大程度上限制了多交联方式、多材料打印的研究，使异质组织/器官的构建更为困难。近日，浙江大学机械工程学院杨华勇院士团队和牛津大学崔占峰院士团队合作在Biofabrication（影响因子11.061）发表题为“A Versatile Embedding Medium for Freeform Bioprinting with Multi-Crosslinking Methods”的文章，基于疏水改性的羟丙基甲基纤维素和Pluronic F-127间的疏水缔合作用提出一种适用于多交联方式、多材料通用型支持浴，能够兼容光交联、pH交联、离子交联、酶交联及温度交联等交联方式，实现多交联方式多材料在同一支持浴内的同步构建。本文的通讯作者为浙江大学机械工程学院周竑钊副研究员与牛津大学工程科学系叶华副教授。

背景介绍
在传统挤出式生物打印过程中，生物墨水的可打印性与其生物相容性存在矛盾，墨水需要较高材料刚度才能在重力作用下保持特定的三维结构，然而，较高的材料刚度通常会降低细胞功能，例如细胞粘附、迁移和增殖等，同样的，具有良好生物相容性的软材料通常缺乏可打印性，使其难以成形。将支持介质从空气改为支持浴，以在生物墨水固化之前将其保持在原位是一种新兴的打印方法，称为嵌入式打印。目前已经有多种支持浴材料被开发出来，并用于复杂三维结构的打印。但是由于目前支持浴在打印窗口大小、对生物墨水或交联剂的兼容、支持浴去除、生物相容性等方面存在局限性，限制了多交联方式多材料在支持浴内的生物组织模型构建，进而使异质组织/器官的体外构建更为困难。

因此，研究团队针对多交联方式多材料在支持浴内的构建难题，基于疏水改性的羟丙基甲基纤维素和Pluronic F-127间的疏水缔合作用，提出了一种具有可调的打印窗口、兼容大多数生物墨水和交联剂、可方便去除的支持浴材料。在研究了该材料的流变特性、稳定性和可打印性后，构建了不同具有分支的管状结构，以评估打印精度、支持浴的可洗脱性和生物相容性，并利用该支持浴材料支撑光交联、pH交联、离子交联、酶交联及温度交联等交联方式在支持浴内的复杂结构构建，此外，还实现了多交联方式多材料在同一支持浴内的同步构建。进一步的，作者还提出一种基于支持浴温敏特性的界面增强打印方法，能够适用于多种交联方式的软材料打印，提高层间连接强度。

图1 支持浴内多交联方式多材料打印方法及材料原理示意图

实验结果
1. 支持浴材料流变性能
利用疏水改性的羟丙基甲基纤维素和Pluronic F-127间的疏水缔合作用可以构建出具有可调屈服应力的支持浴材料，因此，作者检测了5-15% Pluronic F-127结合2-4%羟丙基甲基纤维素的流变特性，通过温度扫描、剪切速率扫描、频率扫描、触变性扫描等测试，作者发现支持浴的屈服应力可以通过两种材料间的相对浓度进行调控，在室温（26 ℃）下支持浴的屈服应力可以在0.59-91.11 Pa之间任意调控。作者在支持浴中加入聚乙二醇后，通过改变支持浴中Pluronic F-127与水分子间的水合作用，可以显著降低材料体系的黏度，这使得支持浴材料的洗脱更为便捷。进一步的作者在支持浴中加入酶、离子和氢氧化钠以验证其对多种交联剂的兼容性，在加入不同交联剂后，复合支持浴材料体系依旧拥有一定的屈服应力与良好的触变性，能够为多交联方式多材料打印提供打印平台。

图2 支持浴材料流变性能

2. 支持浴内打印稳定性与精度
为了探究在支持浴内进行嵌入式打印的稳定性与打印精度，作者首先使用了粒子图像测速法（PIV）对不锈钢圆柱针头在支持浴内移动所产生的速度场进行探究，对比不同支持浴屈服应力、针头直径和移动速度对移动方向平行、垂直的两个方向的速度场扰动的影响，更大屈服应力的支持浴材料能够提供更稳定的流场，其速度扰动收敛的越快，此外，针头直径和移动速度对归一化后的速度场扰动无显著影响。其次，作者在支持浴内以不同的速度和挤出压力打印甲基丙烯酸化明胶（GelMA）,获得了膨胀、相等、拉伸表现的规则线条以及堆积、破裂的不规则线条，为了优化打印精度，作者针对相等的规则线条进行进一步探究，其线条表面粗糙度表现良好，直径波动小于10%，直径可以依据质量守恒定律通过气压进行预测。因此，该支持浴材料可以通过改变流变特性提供较好的稳定性，改变气压和移动速度可以预测、优化打印直径，提高打印精度。

图3 支持浴的稳定性及在支持浴内打印精度研究

3. 具有分支的复杂管状结构构建
为了验证支持浴材料能提供的打印精度及其生物相容性，作者在支持浴内打印了具有不同分支特征的管状结构，在经历嵌入式打印、洗脱等步骤后，作者在具有不同特征的管状结构（不同分叉角的Y管结构，分叉-汇合结构，二分叉结构）内通入带有荧光粒子和染料的PBS溶液，溶液可以顺利的从入口流到出口，这一结果表明打印的结构具有完整性和通透性。进一步的，作者对比了在支持浴打印的管状结构与在空气中打印的管状结构，空气中打印的管状结构在生物墨水的温敏特性和打印平台、环境温度的作用下，无法保持均一的管状结构，呈现上窄下宽的特征，与之相反，在支持浴内打印的管状结构其管径均一。检测两种方法打印的管状物的细胞行为，无显著的存活率、细胞形态和增殖能力的变化。综上所述，所提出的支持浴材料能够满足高精度复杂三维组织的体外构建，并且有较好的生物相容性。

图4 支持浴内复杂管状结构构建及其灌注结果

图5 支持浴生物相容性实验

4. 多交联方式多材料支持浴内同步构建
论文所提出的支持浴材料体系基于疏水改性的羟丙基甲基纤维素与Pluronic F-127疏水缔合作用，通过Pluronic F-127与水的氢键进行支持浴屈服应力的调节，因此，在不具有强亲水、强疏水作用的添加物作用下，支持浴的屈服应力和触变性不会发生显著变化。继而作者在支持浴内打印GelMA、明胶、海藻酸钠、胶原、壳聚糖等材料以形成复杂三维结构，在光照、温度、酶、离子和pH等交联因素的作用下，这些结构能够被交联固化并且从支持浴中洗脱出来。进一步的，在支持浴内加入氯化钙和胶原酶，同时打印GelMA、海藻酸钠、明胶等生物墨水，能构建出多交联方式多材料复杂三维结构。

图6 多交联方式多材料在支持浴内的构建

5. 支持浴内构建界面连接增强的软材料三维结构
在Pluronic F-127中PEG基团的影响下，支持浴材料的黏度随着温度的上升而上升，而GelMA、明胶等生物墨水的黏度随着温度的上升而下降，因此，利用支持浴与生物墨水间相反的温敏特性，作者提出了一种界面连接增强的制造方式。在支持浴内完成生物墨水打印后，将整体放置于较高温度下十分钟，使生物墨水的黏度下降而有利于层间溶液，与此同时，支持浴的黏度上升，这防止了生物墨水的外溢。该打印方法能够显著增强GelMA、明胶等温敏材料的层间黏合强度，为解决3D打印固有的层间黏合强度差的问题提供一种解决方案。

图7 基于支持浴内嵌入式打印的界面增强打印方法

总结
本研究提出了一种基于水改性的羟丙基甲基纤维素和Pluronic F-127间的疏水缔合作用的支持浴材料，该材料由于组分间结合方式，能够在多种无强疏水和强亲水交联剂的作用下保持屈服应力和触变特性，因此能兼容多种生物墨水和交联剂，此外，在聚乙二醇的作用下该支持浴材料的黏度会被显著降低，由此方便其洗脱过程。该支持浴材料能够提供较好的嵌入式打印稳定性和打印精度，并且具有较高的生物相容性。此外，基于该材料的通用型，作者在支持浴内打印了GelMA、明胶、海藻酸钠、胶原、壳聚糖等材料，通过光交联、pH交联、离子交联、酶交联及温度交联等交联方式进行固化，实现体外多交联方式多材料同步构建。本研究所提出的支持浴材料能够为多材料复杂三维组织/器官的体外构建奠定基础。

文章来源：
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/ac7909