香港理工大学赵昕、梅全静等 | 机械拉伸3D水凝胶诱导神经干细胞的分化

来源：生物设计与制造

本研究论文聚焦3D力学微环境诱导神经干细胞(NSC)的定向分化。NSC的定向分化对神经再生研究和神经系统损伤的治疗起着重要作用，在众多影响神经分化的因素中，力学微环境是关键的要素之一。既往的神经力学研究多局限于二维环境(2D)，即使用2D基质来阐明机械刺激对神经分化的影响，然而这些2D基质难以模拟体内NSC三维环境(3D)。鉴于此，本研究制备了一系列柔软且有弹性的3D水凝胶来模拟神经三维力学微环境，并研究了基质刚度及机械拉伸对NSC分化的影响。
研究者以甲基丙烯酸酐化明胶(GelMA)和长链聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)为基础，通过调整两者的比例得到了不同模量的仿生水凝胶。研究表明，GelMA-PEGDA水凝胶具有高生物相容性，可支持NSC在3D环境中生长、增殖、分化。通过观察NSC在不同基质刚度的水凝胶中的状态，研究者发现NSC在相对较硬的基质中更倾向于分化成为胶质细胞，而在相对较软的基质中更倾向于分化成为神经细胞。进一步的3D拉伸实验证明，机械拉伸可以显著增强NSC的分化和轴突的生长，而且神经轴突更倾向于向拉伸方向延伸。免疫细胞化学和相关基因表达也表明，机械拉伸可以上调神经分化蛋白和基因的表达。总体而言，本文不仅丰富了NSC在3D力学微环境中定向分化的研究，而且为神经干细胞治疗的有效性和可行性提供了基础。

图1 GelMA-PEGDA水凝胶合成和物理化学表征

图中展示了GelMA和PEGDA的合成示意图及1H-NMR核磁谱图(a，b)；研究者随后测试了不同GelMA-PEGDA水凝胶的力学性能：机械拉伸(c-e)，循环拉伸(f-h)及压缩性能(i-k)

图2 小鼠神经母细胞瘤细胞(N2a)在GelMA-PEGDA水凝胶表面(2D)的活力、形态及增殖

研究者将N2a接种在不同GelMA-PEGDA水凝胶表面，首先通过活/死染色确定N2a细胞的活力(a)，结果表明细胞在水凝胶表面保持90%以上的存活率(c1)；细胞骨架染色显示N2a细胞呈球形，细胞数量随培养时间增加(b)；定量细胞增殖结果(c2)也表明细胞随培养时间增加而增加，证明GeMA-PEGDA水凝胶具有出色的细胞相容性

图3 N2a 细胞在GelMA-PEGDA水凝胶表面的分化

证明了GelMA-PEGDA水凝胶较高的细胞相容性之后，研究者进一步探讨了N2a细胞在GelMA-PEGDA水凝胶表面的分化。不同时间的细胞骨架染色(a)及免疫荧光染色(b)均表明N2a细胞形态由圆形变为梭形，且观察到明显的突触生长(c1)和相关蛋白及基因的表达(c2)

图4 GelMA-PEGDA水凝胶基质刚度对3D水凝胶中N2a细胞分化的影响

确认了N2a细胞在GelMA-PEGDA水凝胶表面的增殖和分化，研究者进一步将N2a封装在3D GelMA-PEGDA水凝胶中。活/死染色表明N2a细胞在3D水凝胶中生存和增殖良好(a)；显微镜观察(b)、免疫荧光染色(c)和RT-qPCR (d)显示N2a在较硬的基质中更倾向于分化成胶质细胞而在较软的基质中更倾向于分化成神经细胞

图5 机械拉伸GelMA水凝胶对3D水凝胶中N2a细胞分化的影响

随后研究者研究了机械拉伸GelMA水凝胶对N2a细胞分化的影响。首先活/死染色表明拉伸后的细胞依然保持高的细胞活性(a)；显微镜观察(b)、免疫荧光染色(c)和RT-qPCR (d)显示机械拉伸可以显著提高神经细胞分化，但由于GelMA水凝胶相对较硬，拉伸后N2a细胞更倾向于分化为胶质细胞

图6 机械拉伸GelMA-PEGDA水凝胶对3D水凝胶中N2a细胞分化的影响

研究者进一步研究了机械拉伸GelMA-PEGDA水凝胶对N2a细胞分化的影响。首先活/死染色依然表明拉伸后的细胞保持高的细胞活性(a)；显微镜观察(b)、免疫荧光染色(c)和RT-qPCR (d)显示机械拉伸可以显著增强神经的分化和轴突的生长，而且神经轴突更倾向于向拉伸方向延伸。由于GelMA-PEGDA水凝胶更软，拉伸后N2a细胞更倾向于分化为神经细胞