《Small》：基于双光子技术构建金字塔支架用于胶质瘤培养

来源：EngineeringForLife

胶质瘤是一类常见的中枢神经系统恶性肿瘤，患者预后较差，生存率低下。目前，对于胶质瘤的治疗尚无有效办法，其中重要的原因是现有的细胞培养手段难以保留胶质瘤细胞在体内微环境下的特征，进而限制了对胶质瘤细胞的进一步认识。

微管形成的网络骨架和表皮生长因子受体（EFGR）在胶质瘤侵袭中具有重要作用，但是随着细胞在二维环境中增殖传代，EGFR复制和微管形成均受到抑制。三维培养更接近真实的体内微环境，而有利于追踪、检测细胞生物学行为。

来自荷兰代尔夫特理工大学Angelo Accardo教授团队使用双光子聚合技术（2PP）构建了一种新型的三维支架，可模拟体内微环境用于培养胶质瘤细胞。

相关研究成果近日以题为“3D-Engineered Scaffolds to Study Microtubes and Localization of Epidermal Growth Factor Receptor in Patient-Derived Glioma Cells” 发表在《Small》上。

1. 三维支架的制备
支架的设计借鉴了体内肿瘤细胞所处的微环境。胶质瘤细胞在体内易在血管分支处增殖、迁移、聚集。因此，作者设计了一种与血管网络相似的多孔结构。作者使用2PP技术进行支架制备，支架的基本单元为立方体（50μm），中间伴有一个斜行连接杆，数个小的立方体再堆积形成一个金字塔结构（370μmx370μmx190μm）。空隙的大小要求略大于细胞核从而能促进细胞的迁移和物质运输，同时有利于形成蜂窝状结构。

图1 三维支架的制备

2. 三维支架上细胞的形态与结构
使用Tublin标记发现，标准细胞系（U-87）和四种患者来源的胶质瘤细胞（GS-580, GS-827, GS-830, 和GS-921）均可成功定植在支架上。扫描电镜显示，定植的细胞可形成长突触，并向立方体中央延伸。相比于二维环境，定植在三维支架上的细胞面积和细胞核面积均明显减小，而细胞圆度两者未见明显差异。进一步对6个胶质瘤样本中的细胞进行测量分析发现，组织样本和三维支架上的细胞核大小以及细胞核圆度均小于二维环境培养下的细胞核。因此，三维支架上培养的细胞在形态与结构上更接近于体内情况。

图2 三维支架上的细胞形态

3. 三维支架上细胞微管形态和EGFR分布
微管是细长的细胞突起，可以形成功能性蜂窝网络结构，对于促进肿瘤侵袭具有重要作用。

三维支架上的细胞可见长而多的细胞突起，且在纳米层面可见。进一步使用GAP-43标记微管蛋白，研究显示，相比于二维培养，三维支架中的微管更短，更细。

EGFR是胶质瘤中常见的受体之一，进一步分析细胞EGFR的分布情况发现，EGFR在细胞中呈点状分布并且靠近细胞核。甚至在三维支架培养的细胞中还分布于细胞突起。整体而言，EGFR在细胞中的分布在二维与三维培养下未见明显差别。

图3 三维支架上细胞的微管结构和EGFR分布

4. 三维支架上细胞迁移特点
使用共聚焦活细胞成像在16.5h内追踪细胞的移动轨迹，细胞在三维支架中的迁移速度仅为二维培养中的1/2，并且沿支架迁移，这与体内迁移模式更加接近。而二维培养细胞迁移的方向更加随机。

图4 活细胞追踪细胞在三维支架上的迁移情况

综上，作者利用2PP技术制备了“金字塔结构”的三维微支架，可成功用于培养人来源的胶质瘤细胞。并且，该支架培养的胶质瘤细胞保留了体内组织的特征，可用于体外研究细胞相互作用以及细胞与微环境之间的相互作用。为胶质瘤相关研究提供了一种全新而可靠的研究模型。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/smll.202204485