《Adv Sci》：软骨内成骨双重调节的三维生物打印各向异性支架重建肱骨头

来源： EngineeringForLife

组织工程学在理论上被认为是一种很有前途的重建生物关节的方法，因此为晚期骨关节炎的治疗提供了一种潜在的选择。然而，到目前为止，在大型生物关节的再生方面还没有取得重大进展。

最近，上海交通大学医学院附属新华医院骨科朱俊峰在《Advanced Science》上发表了题为Regeneration of Humeral Head Using a 3D Bioprinted Anisotropic Scaffold with Dual Modulation of Endochondral Ossification的文章。研究者利用三维打印技术，设计并一步制作了一种兔子肱骨头再生仿生支架，促进了软骨下骨再生。

研究者首先使用激光获取了兔近端肱骨关节的形态，并设计了一种解剖学上正确的仿生支架，然后利用多喷嘴3D打印系统，制备了具有不同生化线索和不同结构的滑膜关节支架，如图1所示。

图1 基于CAD/CAM技术构建了不同结构和组成的兔肱骨头支架

随后，研究者进行了生物相容性研究，培养1、3、5、7d后，BMSCs均匀分布于支架内(图2A)。各组间细胞存活率都很高(超过95%)，统计分析表明不同组之间没有显著差异(图2B)。此外，细胞增殖能力随培养时间增加而增强。这些结果表明所制备的生物支架具有良好的生物相容性，可用于细胞的长期生长。

图2 激光共聚焦扫描检测支架的生物相容性

研究者结合不同的生化线索(甲状旁腺激素[PTH]和化学成分羟基磷灰石[HA]分别位于内外区域)用于软骨内成骨的双重调节。外区动态机械刺激联合生长因子PTH抑制软骨内成骨，促进软骨再生；内区动态机械刺激联合HA促进软骨内成骨，促进软骨下骨再生。

经逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测，动态加压和生化刺激组的相关基因表达最高(图3B-D)，且生物力学刺激的基因促进效果要高于生化刺激组。

结果表明，动态机械加压复合PTH双刺激支架能更好地诱导BMSCs向软骨细胞分化，抑制软骨内成骨，而动态机械加压复合羟基磷灰石(HA)则刺激软骨内成骨过程，有利于BMSCs的体外成骨。

图3 模拟柱状支架上软骨层和下软骨下骨层软骨内成骨相关基因的表达

为了从蛋白质水平进一步评价生物3D打印支架对骨髓间充质干细胞软骨内成骨过程的调控作用，研究者在体外培养30d后对不同支架的外层和内层进行了Col-II和Col-X的免疫荧光染色。如图四所示，双刺激组显著高于单刺激组高于无刺激组，与基因检测结果一致，表明在甲状旁腺素动态加压的协同作用下，抑制了BMSCs的软骨内成骨和成软骨能力，而在生物力学刺激和HA诱导的联合作用下，显著促进了软骨内成骨的发展。

图4 体外刺激后Col-II和Col-X的免疫荧光分析

进一步平均不同刺激物对软骨再生的促进作用，组织学分析显示，非刺激组表面仅见少量散在的软骨组织。相反，染色显示支架表面生成的软骨组织的厚度和覆盖率逐渐增加(图5)。

在生化、生物力学和双重刺激组中。双刺激组表层再生较厚、连续的软骨，有较好的ECM沉积，SO/FG染色显示软骨基质增多，HE和Masson染色显示细胞填充良好。相比之下，生化组和生物力学刺激组的软骨较薄。

图5 各组体外刺激后肱骨头硬组织切片的组织学观察

接下来研究者对肩关节进行X光和MRI扫描，以评估植入的肱骨头修复的固定和再生组织的形成(图6)。从新生骨密度、再生肱骨形状、是否脱位等方面，双刺激组最好，单刺激组次之，均优于无刺激组。

图6 植入支架后4个月拍摄肩关节X线片和MRI照片

最后研究者对体内再生肱骨头的炎症、组织学和力学评价，得到了双刺激组炎症下降最明显的结论。并在4个月后对动物实施安乐死，并收集标本进行大体观察。结果显示，在无刺激组中，残留的肱骨头支架中新形成的组织大部分为纤维化组织，几乎没有软骨和骨再生。且从视觉组织学评估量表、机制密度、软骨体积等方面，双刺激组结果均最好(图7)。

再软骨下区域，再生骨量在双刺激组中最高，其次是生物力学组、生化组（图 8A）,并且没有刺激组。骨体积/总体积比(BV/TV)、骨表面/骨体积比(BS/BV)和成骨细胞数量的定量分析进一步验证了这一趋势（图8B-D）。

这些结果表明，生物力学刺激促进了再生软骨组织的软骨内骨化过程，加速了成熟骨组织的形成。

图7 体内半肩关节置换术后肱骨头软骨再生的组织学检查

图8 体内半肩关节置换后肱骨头软骨下骨再生的组织学检查

综上，研究者展示了一种3D生物打印支架，具有各向异性结构和类似于天然肱骨头的异质成分。通过动态压缩和调节软骨内骨化的生化线索的双重刺激，实现了透明软骨和软骨下骨的各向异性再生。这种方法还为设计和制造具有临床相关尺寸的解剖学上匹配的大型植入物提供了替代方案。

文章来源：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/advs.202205059