3D打印动态多器官芯片！为2型糖尿病研究打下基础

来源：EngineeringForLife  

2型糖尿病（T2D）是一种高发病率的慢性复杂疾病，对各种器官造成严重损害。T2D有许多病因尚未被完全阐明。尽管已经建立了各种模型来了解T2D，但重建T2D的组织特异性微环境和并发症仍然十分困难。近日，来自韩国浦项科技大学的Dong-Woo Cho、韩国天主教大学的Jae Yon Won教授团队进行了3D细胞打印进行2型糖尿病模拟的组织特异性多器官片上病理生理学重建的相关研究。研究成果以“Pathophysiological Reconstruction of a Tissue-Specific Multiple-Organ On-A-Chip for Type 2 Diabetes Emulation using 3D Cell Printing”为题于2023年03月09日发表在《Adv. Funct. Mater.》上。

本文开发了一个动态多器官芯片，模拟高血糖环境下T2D和内脏脂肪组织（vAT），使用3D细胞打印与脱细胞外基质（dECM）。该芯片由与T2D密切相关的胰腺、脂肪组织和肝脏独立部分组成，并增加了视网膜以确认T2D并发症情况。此外，在高血糖环境下，T2D的病理特征在带有vAT衍生的dECM生物墨水芯片中清楚揭示。引起了视网膜区细胞功能障碍。此外，在芯片上治疗T2D药物显示出临床上相同的疗效。该芯片适用于再现T2D关键特征，是一个有前途的药物测试和T2D并发症研究平台。

图1 对sadECM和vadECM生物汇的评估

通过脱细胞方法，制备了sadECM和vadECM生物汇。生物汇在4℃时保持流体状态，在37℃孵化后表现出热交联行为。对sadECM和vadECM与原生组织进行生化评估比较表明脱细胞过程几乎没有留下DNA，但其他细胞外基质（ECM）成分，如胶原蛋白和糖胺聚糖（GAG）都高度保存。因此，使用脱细胞工艺制备的生物汇充分去除细胞成分，并且适合于保持ECM成分。使用人类脂肪来源的干细胞（hASC）在2%的胶原蛋白、sadECM和vadECM生物墨水中进行活/死检测和细胞计数试剂盒（CCK）检测。活/死试验显示，生物墨水都具有良好的生物相容性。包裹的hASCs在14天内保持高活力。特别是，vadECM生物墨水显示出最高的增殖率。以上结果证实，使用3D生物打印技术开发的结构可以在细胞存活的情况下进行制造，而且预处理的生物墨水有足够的物理特性来支持该结构。

图2 sadECM和vadECM生物汇对脂肪生成分化、细胞因子分泌和巨噬细胞活性的影响

在糖尿病病理环境中，脂肪细胞产生的细胞因子会吸引激活巨噬细胞。被激活的巨噬细胞产生促炎细胞因子，增加脂肪组织（AT）慢性炎症。炎症状态的扩大直接影响葡萄糖代谢，增加T2D发展的可能性。在这方面，本文进行了实验来分析各生物墨水的脂肪细胞分化能力和巨噬细胞诱导的趋化因子分泌能力。将hASCs分化为脂肪细胞后，进行油红O染色，检查vadECM、sadECM和胶原蛋白生物墨水涂层组脂质数量。与其他组相比，vadECM生物墨水组的脂肪细胞产生了更多的脂肪生成表型和更多的脂质。此外，在vadECM生物墨水组中，细胞是最大的，因为它们含有最多的脂质。白细胞介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在有或没有巨噬细胞的vadECM生物墨水组中检测到最高水平。因此，证明vadECM在产生由细胞因子分泌诱导的炎症状态方面优于sadECM。为了证实生物墨水和巨噬细胞之间的相关性，本文进行了细胞迁移试验。结果显示在AT室中有vadECM的组中，巨噬细胞的迁移最为活跃。以上结果表明，vadECM支持差异化成脂线和封装细胞生存。此外，它还增加细胞因子的产生，促进了免疫细胞迁移或增殖，与sadECM相比较。使用vadECM可以提高T2D相关炎症的进展。因此，在T2D芯片上使用vadECM可以可靠地模拟T2D的病理环境。

图3 三维细胞打印的组织特异性多器官片上模型和多器官相互作用的影响

将不同类型的器官整合到一个芯片中，作为T2D体外疾病模型。使用定制的3D细胞打印机制造T2D芯片，选择合适的细胞和生物墨水。使用定制的多头打印机的好处是可以在短时间内一步到位生产芯片，大大改善了细胞的生存能力，有利于精确和可重复的组织特异性微环境生产。实际制造的T2D芯片的每个隔室包含每个器官衍生的dECM生物墨水，每个器官衍生的细胞封装在其中，人脐静脉内皮细胞（HUVECs）作为一个单层位于每个隔室的顶部。同时在芯片上验证了各器官之间的相互联系，并确认了芯片上根据器官顺序的代谢状况的变化。在双器官芯片中，蛋白也被检测到，但它们的表达明显高于单器官芯片中的表达。综合芯片在所有代谢物中显示出最高的蛋白质水平。这些结果表明，芯片上各器官之间的相互作用可以显著提高代谢物水平。此外，为了证实对每个器官进行分隔的效果，本文比较了空间不分隔芯片和空间分隔芯片的功能，结果显示所有确定的标记物在空间分离芯片中都比在空间不分离的芯片中明显检测得好。内皮细胞的单层排列对产生成熟的血管结构至关重要，这对表达器官的成熟表型和每个器官的正常功能都很重要。因此，芯片中必须有分层的内皮细胞，以模拟功能正常的器官。

图4 T2D芯片在T2D并发症研究中的适用性

T2D相关器官有几种并发症，特别是与眼睛有关的并发症很容易在体外模拟。本文通过连接一个正常的视网膜区间，将T2D的概念扩展到T2D组合模型。为制作一个合适的T2D并发症模型。本文实验了装有vadECM的模型是否比装有sadECM或collagen的模型更接近于模拟T2D并发症。连接T2D的正常视网膜室在芯片上稳定了5天，用注射泵在特定的葡萄糖浓度下操作了2天。为了比较不同模型之间的功能，从每个芯片上收集了装有RPE细胞的透析细胞，确认紧密连接的崩溃程度和RPE细胞内在功能变化。用相同的标记物进行qRT-PCR，以交叉检查免疫荧光染色结果。在用vadECM和高糖培养基处理的芯片中，所有标记物的表达都减少了，显示了强烈的T2D特征。本文测量了各组跨膜电阻（TEER）值，定量紧密连接的破坏程度，以确认RPE的功能。在高糖环境下配备vadECM的组的TEER值最低，表明该组的紧密连接是最崩溃的。综上所述，在高血糖环境下，装有vadECM芯片的炎症细胞因子分泌量最高，从而主动促进了RPE紧密连接的破坏，影响了RPE细胞的内在功能。在这个模型中观察到的由T2D条件引起的视网膜功能障碍证实了T2D芯片在T2D并发症研究中的资格。

图5 T2D芯片上治疗T2D的商业药物的反应水平

接着研究人员检查了治疗T2D药物是否在芯片上正常工作。Tol促进胰腺分泌胰岛素。Met阻碍肝脏的葡萄糖生成途径，激活AMPK途径，促进葡萄糖流入细胞。因此，Tol和Met最终可以降低BGL。为了证实T2D芯片作为药物测试平台的潜力，我们制作了三种类型的模型。结果显示在T2D模型中出现了葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗，但在正常模型中没有。在T2D+Tol+Met模型中，从用Tol+Met治疗开始，葡萄糖浓度下降，胰岛素浓度迅速上升。相反，在没有药物治疗的T2D模型中没有发生。表明T2D治疗剂恢复了细胞的功能，包括葡萄糖的吸收。随后，随着各器官细胞对葡萄糖吸收的进展，葡萄糖浓度下降到正常范围，导致胰岛素分泌自然逐渐减少。在没有药物治疗的T2D模型中，过度持续的胰岛素分泌降在T2D模型中，持续的高血糖导致细胞膜崩溃，影响了INSR在细胞膜上的预发送。因此，与正常模型相比，INSR表达减少了。此外，由于炎症细胞因子的增加，INSR磷酸化被抑制。

在T2D+Tol+Met模型中，细胞功能，包括细胞膜重建，得到了恢复。因此，与T2D模型相比，INSR的表达有所增加。此外，INSR的磷酸化得到恢复，从而重新启动葡萄糖代谢，降低了BGL。用Met处理时，TNF-α和IL-6水平下降。每组不同的ELISA结果表明，Tol和Met达到了相同的T2D治疗功效，但有不同的作用机制。在用Tol治疗的T2D患者中，分泌了更多的胰岛素。在用Met治疗的T2D患者中，炎症细胞因子的分泌减少。这些结果通过临床试验得到了证实。芯片上的药物治疗模式与在试验中观察到的病人一致。因此，该芯片可以作为T2D治疗药物的精确测试平台。

总之，本文开发了一个模拟T2D的3D细胞打印多器官芯片。胰腺、AT和肝脏用组织特异性的dECM生物汇打印，并与一个灌注系统相互连接。开发的vadECM明显增加了巨噬细胞和脂肪细胞中炎症因子的产生。用来模拟T2D的病理环境。炎症因子的释放趋势与一些临床研究报告的T2D患者一致。芯片的制作采用最适合T2D模拟的器官分区和器官排列顺序。所有隔间的血管都能改善器官功能。在芯片运行过程中，葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗的发生以及炎症细胞因子的释放导致葡萄糖代谢受损，导致整个胰岛素信号传导途径出现问题。此外本文还分析了该芯片在研究T2D并发症和药物测试方面的有效性。与T2D芯片相连的RPE细胞在模拟器官并发症的功能上出现了严重的问题。每种T2D治疗药物的机制在T2D芯片中可精确操作。该芯片对各种T2D并发症的研究具有很大价值，可作为T2D药物开发的精确测试平台。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202213649