华中科技大学材料学院张祥林、吴斌课题组关于冷冻3D打印系列研究

来源: EngineeringForLife

冷冻3D打印/低温沉积制造是将低温场引入传统的挤出沉积成型、静电纺丝等3D打印技术形成的一种新型3D打印方法。低温可以使打印浆料在三维支架成型的过程中发生相分离，原本均匀浆料中的溶剂会结晶析出；在后续的处理过程中将溶剂结晶升华可留下微米级孔洞。如此，可制备具有大孔（100 μm级别）和微孔（1 μm级别）的多级孔三维支架，其多级孔结构能模拟天然组织的结构形貌、提供供养通道、增加载药能力和矿化面积等，使得多级孔支架相较于单级孔支架有更多优势。而且低温沉积制造技术可用的生物材料范围广泛，低温场对生长因子和细胞较为友好，这些优点使得低温沉积制造技术在组织工程和再生医学领域很有应用前景。

华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的张祥林、吴斌课题组自2019年至今针对冷冻3D打印/低温沉积制造进行了系列研究，与华中科技大学同济医学院附属协和医院合作，在Chemical Engineering Journal (2), Bioactive Materials (1), Biofabrication (2) 和Materials & Design (2)等期刊上共发表了7篇文章，简介如下：

1. 冷冻静电纺丝方法制备的用于胃肠道黏膜修复的仿生双面膜

大面积的胃肠道黏膜缺损难以修复，致死率高。现有的人工黏膜制备研究忽视了天然黏膜的褶皱结构与上皮细胞和成纤维细胞之间的旁分泌作用这两个特征，导致黏膜修复不充分。受天然黏膜解剖结构的启发，本文通过冷冻静电纺丝技术制备了一种具有仿生结构的双面电纺膜。首先，冷冻电纺膜的结构与天然消化道黏膜类似，外表面具有褶皱结构，内表面平整。褶皱结构和冷冻电纺丝上的微米孔促进了上皮细胞的增殖。其次，本研究在双面膜的外表面和内表面上分别培养了上皮细胞和成纤维细胞以模拟天然消化道黏膜层的细胞组成。双面膜在隔离这两种细胞直接接触的同时，实现了上皮细胞和成纤维细胞间的旁分泌作用：成纤维细胞分泌的EGF可以通过双面膜，刺激另一面的上皮细胞转录更多的c-Myc和Mcl-1，进而在增加上皮细胞的再生和抗菌能力。总结，本文提出的冷冻静电纺丝双面膜实现了对天然胃肠道黏膜的褶皱结构和旁分泌作用这两大特点的仿生，为消化道黏膜的大面积缺损提供了一种很有潜力的修复方案。

图1 冷冻电纺双面膜模拟天然消化道黏膜的褶皱结构及旁分泌作用

图2 a）天然小鼠食道黏膜中的上皮层（E）和固有层（L）的双层结构

图3 双面膜的表面形貌：a）粗糙面；b）平整面

图4 上皮细胞细胞核朝向的分布统计：a）粗糙面；b）平整面

相关研究成果以“Biomimetic Janus film fabricated via cryogenic electrospinning for gastrointestinal mucosa repair”为题于2023年3月20日发表在《Materials & Design》上。通讯作者为华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的吴斌博士、讲师，和华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科白涛副教授、副主治医师。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2023.111839

2. 低温沉积制造的脱细胞基质支架用于双生长因子次序释放以促进原位骨再生

原位组织工程是治疗骨缺损的一种强有力的策略，它是指不需要在支架上预负载细胞，而是通过支架本身的结构和材料创造一个类似天然骨的微环境，吸引人体内干细胞归巢，在支架处原位修复骨缺损的方法。它可以避免传统的骨组织工程支架所需的细胞扩增步骤、低细胞存活率及免疫排斥风险。本文通过低温沉积制造技术制备了聚己内酯（PCL）/小肠黏膜下层脱细胞基质（dSIS）双材料多孔支架，随后在支架中负载了两种活性生长因子（适配体（Apt19s）和PlGF-2123-144*融合的BMP2（pBMP2））进行表面修饰。两种生物活性分子与支架中dSIS的亲和力强弱不同，因此可按次序相继释放。首先，适配体Apt19s快速释放，它对骨髓间充质干细胞（BMSCs）表现出结合亲和力，可将干细胞吸引至支架上，完成归巢。其次，pBMP2缓慢释放，可促进已归巢的干细胞发生成骨分化。体外实验结果表明低温沉积制造多孔支架的双生长因子次序释放促进了细胞迁移、增殖、碱性磷酸酶活性，以及成骨相关基因的mRNA表达。体内结果表明了这一释放系统显著增加大鼠颅骨临界尺寸缺损的骨修复。因此，本文证明了低温沉积制造多孔支架作为新型药物释放平台所显示的实现无细胞原位骨再生策略的潜力。

图5 低温沉积制造的PCL/dSIS支架及其促进原位骨再生的能力

相关研究成果以“In situ bone regeneration with sequential delivery of aptamer and BMP2 from an ECM-based scaffold fabricated by cryogenic free-form extrusion”为题于2021年4月发表在《Bioactive Materials》上。通讯作者为华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的吴斌博士、讲师，和华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的郭晓东教授、主任医师，第一作者为孙亭方博士、主治医师。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.04.013

3. 低温沉积制造的载外泌体支架用于糖尿病创面的修复

尽管治疗策略不断改进，糖尿病创面的愈合仍然是一个世界级难题，这是由于高血糖导致的血管功能障碍会导致血供不足、氧化应激和炎性反应，造成创面久久不愈。本文利用低温沉积制造技术制备了猪小肠黏膜下层脱细胞基质（dSIS）支架，将其与介孔生物玻璃（MBG）以及外泌体相结合，构建了3D支架敷料（dSIS/MBG@Exos)，使得外泌体的持续性释放成为可能。dSIS/MBG@Exos水凝胶支架具有良好的多孔性、生物相容性和止血能力，可促进细胞增殖、迁移和人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的血管生成。体内实验结果证明dSIS/MBG@Exos水凝胶支架可增加糖尿病创面的血管生成和血流。dSIS/MBG@Exos水凝胶支架还能促进肉芽组织的形成和胶原纤维的沉积，这些因素都有利于促进创面愈合。总之，这项研究提出了有潜力的治疗糖尿病创面的新策略。

图6 低温沉积制造的载外泌体支架用于糖尿病创面的修复

相关研究成果以“Cryogenic 3D Printed Hydrogel Scaffolds Loading Exosomes Accelerate Diabetic Wound Healing”为题于2021年11月发表在《Chemical Engineering Journal》上。通讯作者为华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的刘国辉教授、主任医师、熊蠡茗教授、主任医师和米博斌博士、主治医师，第一作者为协和骨科的胡益强博士、主治医师和华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的吴斌博士、讲师。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.130634

4. 低温沉积制造含小肠黏膜下层脱细胞基质和Sr2+/Fe3+共掺杂羟基磷灰石的骨组织工程支架

新型的骨生物材料最好能够模拟天然骨的结构和组成，并具有足够的生物多功能性以按时间顺序促进骨再生。本文通过低温沉积制造技术制备了由小肠黏膜下层脱细胞基质（SIS-ECM）和Sr2+/Fe3+共掺杂的纳米羟基磷灰石（SrFeHA）组成的新型仿生支架。这种SIS/SrFeHA支架表现出了理想的互连三维大孔/微孔结构、粗糙微表面和增强的力学强度，同时具有协同释放的生物活性ECM和Sr2+/Fe3+离子。这些良好的物理化学性质使得SIS/SrFeHA复合支架能产生高度仿生的骨骼微环境，可通过免疫调节来增强血管生成、成骨和生物矿化。体内的颅骨缺损和皮下植入实验的结果证实了SIS/SrFeHA支架在刺激早期免疫反应、新生血管形成和体内骨再生等方面的优越能力，表明SIS和SrFeHA的混合能加速骨愈合过程。此外，通过RNA测序分析证明了SIS/SrFeHA复合支架能上调Amot+/YAP-/Hippo信号通路以促进血管生成。因此，本文表明了SIS/SrFeHA复合支架诱导骨愈合的潜力，同时更好地阐述了活性SrFeHA成分的潜在机制，从而可能提供了一种新的有前景的未来骨组织工程植入物。

图7 低温沉积制造含小肠黏膜下层脱细胞基质和Sr2+/Fe3+共掺杂羟基磷灰石的骨组织工程支架

相关研究成果以“Cryogenically 3D printed biomimetic scaffolds containing decellularized small intestinal submucosa and Sr2+/Fe3+ co-substituted hydroxyapatite for bone tissue engineering”为题于2021年11月发表在《Chemical Engineering Journal》上。通讯作者为华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的张祥林教授，和华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的郭晓东教授、主任医师，第一作者为杨亮博士。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.133459

5. 低温沉积制造的多孔Sr2+/Fe3+共掺杂羟基磷灰石骨组织工程支架

开发具有生物多功能的多掺杂生物陶瓷对骨组织工程很有吸引力和前景。据此，本课题组此前已设计了掺杂浓度固定在10 mol%的系列梯度Sr2+/Fe3+共掺杂纳米羟基磷灰石（SrFeHA）。为评估其促进骨愈合的潜力，本文将其与聚已内酯（PCL）混合，通过低温沉积制造技术制备了新型的梯度SrFeHA/PCL支架。制备的支架展示出了良好的三维互连多孔结构和粗糙微表面，以及具有生物活性的Sr2+/Fe3+。这些有利的物理化学性质使支架实现了体外和体内的有效生物应用，特别是中度共掺杂的Sr7.5Fe2.5HA支架和Sr5Fe5HA支架表现出了显著增强的生物活性，不仅直接促进了MC3T3成骨细胞和HUVECs的功能，而且还可以刺激巨噬细胞活化，同时促进成骨/血管生成。此外，体内皮下植入和颅骨缺损修复实验的结果进一步证实了它们通过释放Sr2+/Fe3+引发免疫反应、促进植入物血管化和原位骨再生的优越能力。综上，本文展示了Sr7.5Fe2.5HA和Sr5Fe5HA复合支架通过偶联血管生成/成骨和免疫调节促进了骨再生进程，因此可能提供了一种新的骨组织工程植入物。

图8 低温沉积制造的多孔Sr2+/Fe3+共掺杂羟基磷灰石的骨组织工程支架

相关研究成果以“Bioactive Sr2+/Fe3+ co-substituted hydroxyapatite in cryogenically 3D printed porous scaffolds for bone tissue engineering”为题于2021年4月发表在《Biofabrication》上。通讯作者为华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的张祥林教授，和华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的郭晓东教授、主任医师。

文章来源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/abcf8d

6. 低温沉积制造的多孔聚已内酯组织工程支架

本文基于低温沉积制造（-20℃）和后续的冷冻干燥制备了高孔隙率、高保真度的聚己内酯（PCL）支架。冷冻干燥在一定程度上导致支架沿X、Y和Z轴收缩。CP600，CP800和CP1000三种支架的孔隙率分别为64.0±1.2%、70.1±1.3%和74.3±0.6%。本文对低温沉积制造（ECP）的支架进行了多种结构特征表征，并将之与通过传统熔融3D打印（EMP）制备的支架进行了比较。ECP支架中PCL的结晶度（57.1±2.2%）低于EMP支架（69.8±1.3%）。ECP支架表现出了更高降解性和较低的抗压性能。此外，ECP支架促进了MCT3T-E1细胞的黏附和增殖，并使其表现出了良好的舒展形态。总之，本文证明了低温沉积制造的PCL支架具有潜在的组织工程应用。

图9 低温沉积制造的多孔聚已内酯组织工程支架

相关研究成果以“Fabrication and characterization of porous polycaprolactone scaffold via extrusion-based cryogenic 3D printing for tissue engineering”为题于2019年6月发表在《Materials & Design》上。通讯作者为华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的张祥林教授和李文超博士（现为南昌大学先进制造学院讲师）。

文章来源：https://doi.org/10.1016/j.matdes.2019.107946

7. 低温沉积自由成形小肠黏膜下层脱细胞基质支架在皮肤组织工程中的潜在应用

本文提出了一种低温沉积自由成形的3D打印策略，用以打印小肠黏膜下层脱细胞基质（dSIS）多孔支架。dSIS的流变性能包括动力粘度、储能模量（G′）和损耗模量（G〃）等均适用于挤出成型。本文制备了三组不同的支架：P500、P600和P700，它们的丝间距（多孔支架中相邻两根纤维间的距离）分别为500、600和700 μm。打印参数包括：5mm/s的平台工作速度（Vxy）、25 kPa的挤出压力（P）和-20 ℃的制造温度。支架尺寸在制备过程中会发生变化，因此，本文对冷冻打印支架的初始状态、冷冻干燥后的状态和使用模拟体液（PBS）清洗后的状态进行了比较；并且比较了P500、P600和 P700支架的杨氏模量。细胞实验结果表明，细胞在支架表面和内部生长良好，细胞的黏附程度、活性和增殖率均得到了增加。此外，体外基因和蛋白质表达结果表明dSIS支架可以促进皮肤成纤维细胞分泌一些细胞外基质蛋白（即I型胶原、III型胶原和纤连蛋白）。综上，本文提出了一种新策略，通过结合低温沉积制造技术和脱细胞的细胞外基质材料制备了理想的皮肤组织工程支架。


相关研究成果以“Cryogenic free-form extrusion bioprinting of decellularized small intestinal submucosa for potential applications in skin tissue engineering”为题于2019年5月发表在《Biofabrication》上。通讯作者为华中科技大学材料科学与工程学院、材料成形与模具技术国家重点实验室的张祥林教授，和华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科的熊蠡茗教授、主任医师，第一作者为石磊博士和协和骨科的胡益强博士、主治医师。

文章来源：https://doi.org/10.1088/1758-5090/ab15a9