《Biofabrication》：热喷墨生物打印显着改变细胞表型

来源： EngineeringForLife

细胞喷墨生物打印，全称为三维细胞打印技术，是一种利用数字控制的喷墨技术，将细胞、生物材料和生长因子等组成部分精确地排列在生物基质上，生成三维生物结构的生物医学技术。该技术于2003年首次被开发出来，并逐渐得到广泛应用。细胞喷墨生物打印的工作原理类似于普通的喷墨打印，但使用的液体不是油墨，而是由细胞、生物材料和生长因子等组成的生物水溶液。这些水溶液错层地依次加注入喷头中，并且通过高频振动或气体压缩来喷出微小的液滴。然后，这些液滴可以准确地落在预设的位置上，建立所需的三维生物结构，最终形成具有特定功能的人工组织、器官或外皮层。

相比于传统的二维细胞培养技术，细胞喷墨生物打印可以创造出具有更高密度和更真实感的细胞模型，具有更好的仿真性和可重复性。同时，这种技术还可以直接将大量的细胞植入到缺陷组织中进行修复和再生，从而避免了传统医疗方案中可能存在的移植物排斥反应和外科手术造成的创伤。截至目前，细胞喷墨生物打印已经成功应用于许多领域的研究和实践中。例如，在组织工程领域，该技术可以用来构建人工骨骼、肌肉、血管等各种不同类型的组织；在外科手术领域，该技术可以用来为患者进行皮肤移植或骨骼修复等手术；在药物研发领域，该技术可以用于筛选新药并评估其治疗效果。然而，与其他新兴技术一样，细胞喷墨生物打印也面临着一些挑战和限制。量化打印机的输入和测量打印机的输出一直是生物打印领域努力的方向，因为几乎不可能表征打印孔或内部的细胞挤压针。

来自美国得克萨斯大学埃尔帕索分校的Thomas Boland团队描述了一些最近因喷墨生物打印而发现的细胞行为。首先，将原代和永生化成人真皮成纤维细胞在接收后扩增 2-3 代，然后收集细胞，将其重悬于 PBS 中，并使用 pluriSTEM 培养基将其生物打印到 96 孔板中。然后将细胞转移到预涂的 96 孔板中，或移取 20 μL 液滴进行悬滴培养。应用 IPC 分化方案并在打印后约 45 分钟开始诱导。当分化聚集体时，起始发生在聚集体转移到 96 孔板中，在 45 分钟后标准免疫染色和 RNA-Seq 分析细胞表型。初步结果表明所有细胞都表达了三种多能性标记 oct-4、nanog 和 sox-2。应用心肌细胞分化方案后，细胞的肌钙蛋白 3 染色呈阳性。细胞也伸长并且在形态上变得更像心肌细胞。本研究分析了大量 RNA 序列数据，本研究的初步结果显示一些与干细胞标记有关的基因上调：EPCAM、LEFTY1、ZFP42 和 TEX19。此外，与多能性相关通路相关的基因的差异表达表明，一些通路已关闭，如预期多能状态的 MAPK/p38、MAPK/JNK1-3。本研究也有数据支持通过 TAZ 高度上调和 YAP 染色细胞体激活河马途径。此外，GSK3B 处于关闭状态，TGFB1、LIF/PIK3 和 AKT1 处于多能性预期状态。检查上调基因的基因网络，可以清楚地区分与多能性相关的 FOS、FOXO1 和 PIK3 的关键作用。生物打印的成纤维细胞至少会暂时采用更原始或去分化的状态，这让人联想到多能性。虽然免疫化学显示了多能性所需的经典转录因子，但基因表达显示了印刷时发生的转化的更微妙的画面。了解这些转变，即使是暂时的，在尝试使用生物打印技术构建组织时也至关重要。相关工作以题为“Thermal inkjet bioprinting drastically alters cell phenotype”的文章发表在2023年5月9日的国际著名期刊《Biofabrication》。

1. 创新型研究内容

图 1 展示了打印后 24 小时 TIB 成纤维细胞的抗体染色，标记有针对 OCT-4（绿色）、Sox2（红色）和 Nanog（红色）的荧光标记初级单克隆抗体。未打印但接受相同处理的对照细胞也显示在图中并且未显示任何染色。还展示了通过悬滴法形成并用三种抗体染色的细胞聚集体的染色。类似于铺板细胞的图像，OCT-4 在所有细胞中表达，但转录因子 Nanog 似乎并未在所有细胞中表达，而是集中在聚集体的内部质量上。虽然 Sox-2 存在于所有铺板细胞中，但它在 2 日龄聚集体中的表达似乎低于新打印细胞中的表达。初步结果表明所有细胞都表达了三种多能性标记 oct-4、nanog 和 sox-2。应用心肌细胞分化方案后，细胞的肌钙蛋白 3 染色呈阳性。细胞也伸长并且在形态上变得更像心肌细胞。本研究分析了大量 RNA 序列数据，本研究的初步结果显示一些与干细胞标记有关的基因上调：EPCAM、LEFTY1、ZFP42 和 TEX19。此外，与多能性相关通路相关的基因的差异表达表明，一些通路已关闭，如预期多能状态的 MAPK/p38、MAPK/JNK1-3。本研究有数据支持通过 TAZ 高度上调和 YAP 染色细胞体激活河马途径。此外，GSK3B 处于关闭状态，TGFB1、LIF/PIK3 和 AKT1 处于多能性预期状态。通过检查上调基因的基因网络，可以清楚地区分与多能性相关的 FOS、FOXO1 和 PIK3 的关键作用。

图1 共聚焦显微镜图像显示 OCT-4、Sox-2 和 Nanog 蛋白以及 DAPI 的染色

图 2 展示了打印后立即接受心肌细胞分化方案的 TIB 成纤维细胞，该细胞用标有 Alexa Fluor 647 的初级肌钙蛋白 I 型 3（心脏）抗体染色。含有镀层成纤维细胞的对照样品进行了相同的分化和染色工艺，但未进行生物打印，结果表明其未显示任何染色。大多数 TIB 细胞显示出细长的矩形细胞形态，并且肌钙蛋白 I 呈阳性，比对照细胞长得多。细胞似乎沿着一个共同的轴伸长，并且在一些图像中可以看到它们相互作用或相互连接。据本研究所知，这是第一次报告这种细胞状态，本研究称之为应变诱导的临时自动启动重编程或 SITAR。在本研究的观察中，这种重新编程是暂时的，并且随着时间的推移，三个标记的表达水平会降低。这可以通过比较 3 至 4 天的聚集体中 Sox-2 或 Nanog 的染色与这些因子在镀层的新鲜印刷细胞中的染色来理解。然而，经过多能干细胞合格培养一周后，仍然可以观察到一些染色。尽管如此，它仍然只出现在细胞体的下部，或者可能与细胞外基质凝胶结合，细胞被接种在凝胶上。SITAR 状态的临时性质也可以解释生物打印文献中缺乏报告的原因，即使生物打印已成为许多实验室广泛使用的工具。大多数团队会在生物打印后添加特定的介质，这种介质已被开发用于维持分化的细胞。本研究假设这些介质加速从 SITAR 状态重新分化为原始细胞类型。

图2 打印后立即接受心肌细胞分化方案的 TIB 成纤维细胞

为了开始了解这一发现的起源，本研究进行了许多基本实验。图 3A 展示打印后 3 小时的 TIB 细胞 YAP（红色）α-微管蛋白（绿色）和细胞核（蓝色）染色，而图 3B 显示打印后 24 小时的细胞。据推测，使用热喷墨打印机时提供给电池的热量可能会导致 SITAR。通过手动将细胞喷射通过打印头中的孔来排除这种热冲击，没有提供外部电源并且仍然观察到正在表达的三种多能标记。然而，当将打印头浸入培养基中时手动迫使细胞悬浮液通过孔口时，不会观察到 SITAR。因此进一步排除了细胞通过 80 um 孔时所经历的剪切可以解释该现象。因此，本研究目前的解释是，细胞周围小液滴的形成是导致去分化的触发事件。本研究打印设置中的液滴大小约为 80 pl，液滴从孔板中出来时有很长很细的尾巴。在这些液滴中，细胞膜在几分之一秒内被拉伸和压缩，这种应变的突然变化被转化为细胞核，在那里开始表达更原始或原始的基因。然而，在这一点上，本研究没有这方面的证据，本研究只是报告 TIB 后 24 小时到几天后的细胞状态。

图3 打印后 3 小时 (A) 和 24 小时 (B) 后表达 YAP（红色）和 Alpha 微管蛋白（绿色）的 TIB 成纤维细胞

图 4 显示了打印后 2 小时和 12 小时与多能性相关通路相关的基因的差异表达。已显示下调和上调的基因分别以红色和绿色显示。图 5 则显示了印后 12 小时 TIB 细胞显着上调基因的基因网络。还应注意，TIB 样本中的所有细胞都表达 OCT-4，大多数细胞表达 Sox-2，并且 Nanog 染色的细胞略少。虽然更传统的多能干细胞生成方法是高度手动的，需要手工挑选用于培养的细胞很少，但 TIB 方法是自动化的，不需要人工干预，这对于称为全自动系统的某些应用程序可能是一个优势，例如用于大批量制造。由于 SITAR 状态的短暂性，本研究没有观察到干细胞样特征在细胞分裂后传递给子细胞。目前本研究还不知道培养物是否可以繁殖。TIB 细胞可以在打印后立即冷冻保存，方法是将 10% DMSO 添加到打印细胞的小瓶中的介质中，并以每分钟 1C 的速度缓慢冷却。在冷冻保存和解冻实验中，按照标准方案去除冷冻保护剂，细胞对测试的三种标记物仍然呈阳性。

图4 多能性相关通路相关基因的差异表达

据本研究目前所知，SITAR 细胞并不是真正的多能细胞。例如，即使表达了指示多能性的标记，在植入 TIB 细胞的十年研究中，本研究也从未在动物身上看到过畸胎瘤的形成。然而，最近植入 SITAR 细胞聚集体的初步实验可能在植入 4 周后显示未成熟的畸胎瘤；这些发现需要在更长的植入时间内重复。这与似乎没有集落形成和将特征传递给子细胞一起，向我们表明 SITAR 细胞的状态是短暂和不稳定的，但可以通过在生物打印后允许细胞聚集来延长。

图5 12小时显着上调的基因网络图

2. 总结与展望
本研究发现成年原代成纤维细胞在 80 pl 液滴内拉伸时至少会暂时采用更原始或去分化的状态，这让人联想到多能性。多能性细胞可以分化成心脏谱系等。这种称之为 SITAR 的现象被认为发生在所有经历应变的细胞中，进一步探索 SITAR 状态可能会导致利用内在潜力和再生医学的新了解。

文章来源：https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1758-5090/acd3b3