来源： EngineeringForLife
在制造大面积和复杂组织工程支架时，水凝胶原位3D生物打印而不使用有毒交联剂是最佳选择，可以使强生物相容性的强化剂加强和均匀分布。近日，来自韩国首尔科技大学的Insup Noh教授团队进行了先进便携式生物笔原位均匀混合藻酸盐-壳聚糖-高岭土生物墨水进行复杂组织支架3D生物打印的相关研究。研究成果以“3D bioprinting of complex tissue scaffolds with in situ homogeneously mixed alginate-chitosan-kaolin bioink using advanced portable biopen”为题于5月29日发表在《Carbohydrate Polymers》上。
图1 用于组织再生大面积均匀生物墨水沉积生物笔挤压与滚筒式附件示意图
本文通过先进笔式挤出机对基于海藻酸盐（AL）-壳聚糖（CH）和高岭土的多组分生物墨水进行了均匀混合和3D生物打印，确保大面积组织重建过程中的结构和生物均匀性。由于聚合物-高岭土纳米粘土氢键和交联的钙离子量较少，AL-CH生物印迹样品的静态、动态和循环机械性能以及原位自立打印能力随着高岭土浓度的增加而明显改善。与传统的混合过程相比，生物工作笔确保了高岭土分散的AL-CH水凝胶有更好的混合效果。在大面积多层3D生物打印过程中引入的两个不同的细胞系（成骨细胞和成纤维细胞）证实这种多组分生物汇在体外甚至组织再生中的适用性。高岭土在整个生物打印凝胶基质中促进细胞均匀生长和增殖的效果对于先进的笔型挤出机处理的样品来说更为显著。
1. 高岭土强化水凝胶
图2 高岭土纳米粘土相关检测
TEM图像中可以看到1:1层状铝硅酸盐的六边形板状结构。SAED图案显示了其结晶结构，大多数高岭土纳米粘土颗粒的直径为200-500nm。能量分散X射线光谱（EDS）中可以发现铝和硅的存在。挤压和干燥的AL-CH-NC 0和AL-CH-NC 4样品表面形态存在孔隙和不规则，有助于细胞的附着和生长。水凝胶表面的高岭土含量很低，在XRD中，10°和20°左右观察到CH的特征峰。与高岭土对应的X射线衍射（XRD）峰相匹配。XRD分析可以确定材料中存在的结晶相，并揭示其化学成分。海藻酸盐-壳聚糖水凝胶的形成打破了海藻酸盐中的羟基和壳聚糖中的氨基之间的氢键，主要由于其在AL-CH组合水凝胶中的无定形结构所导致。在AL-CH-NC 4中，12.5°和25°处的高岭土峰证实了高岭土的存在。原材料和制备的样品的FT-IR结果显示显示，由于甲壳素的部分脱乙酰化，在2873 cm-1处出现了壳聚糖的酰胺峰强度。在AL-CH-NC 4中，在1649 cm-1左右观察到海藻酸的特征峰对应于-COOH基团。在AL-CH-NC 4样品中，3664 cm-1（-OH振动）和1107 cm-1（Si-O拉伸）附近的峰证实了高岭土的存在。
2. 流变学和抗压机械性能及用于3D生物打印循环抗压和机械纹理特性
图3 高岭土纳米粘土与海藻酸盐/壳聚糖水凝胶的流变学和压缩机械性能
没有高岭土加固的样品膨胀程度明显高于高岭土加固的样品，随着高岭土的增加，肿胀程度降低。在第2天，未加固的样品的膨胀仍在继续，而基于高岭土的样品的膨胀较小。表明随着水凝胶中高岭土含量的增加，结构稳定性得到了增强。降解研究显示高岭土对于抑制海藻酸/壳聚糖可挤压水凝胶的降解速度的必要性，钙离子交联剂的用量很少。第4天后，所有基于高岭土的样品的降解率都明显低于纯海藻酸/壳聚糖水凝胶样品。膨胀和降解研究结果表明，高岭土明显改善了这种水凝胶的结构稳定性。在压缩模式测试中，Biowork笔混合的AL-CH-NC 4水凝胶样品显示出比AL-CH-NC 4H水凝胶（常规混合）更好的结果。与AL-CH-NC 0相比，AL-CH-NC 4的循环抗压强度随着高岭土的增加而提高了一倍。传统混合的样品（AL-CH-NC 4H）的循环抗压强度（0.062 ± 0.002 N）低于生物混合的AL-CH-NC 2（0.073 ± 0.003）。其他与印刷有关的性能也较差。分层硅酸盐的硬度促成效果改善，与3D打印相关的性能，如硬度、胶粘性和咀嚼性，随着高岭土纳米粘土的加入而明显提高并呈上升趋势。
3. 优化Biowork笔工作区以提高其挤压能力
图4 对AL-CH-NC Biowork笔挤出优化
本研究中使用的生物工作笔是首创，因此其工作区应针对特定的水凝胶进行优化，以便在挤压式3D打印/生物打印过程中获得连续和均匀的流速。在挤压过程中，在不同的时间估算流速，以找出不同的螺杆转速下的均匀性。在没有任何附着物的情况下，biopen在很宽的螺杆转速范围内显示出挤压的均匀性。在30至54转/分的范围内，挤出的均匀性很好。剖面均匀性表明，使用这种针时，42至54转/分是最合适的。对于22号塑料针，可以使用36-54转/分。对于18至60转/分的区域，r2值达到了0.966。在不同转速下研究的三个挤压部分或区段中，区段均匀性非常高。在18到30的范围内，流速与转速的相关性为0.965，然而在更高的转速下，流速的相关性并不理想。在较高的转速下，辊头中积累的凝胶量较高，可能会引起沉积的不规则性。因此，对于3D打印和生物打印，当辊头用于水凝胶或生物墨水的大面积多层沉积时，选择24rpm。
4. 使用Biowork笔对多成分纳米复合生物墨水进行大面积3D打印时均匀性研究
图5 不同放大倍数3D打印冻干样品的SEM图像
冻干纳米复合凝胶样品的表面形态和EDS图谱显示这些样品使用固定在三维生物打印机中辊头连接的Biopork挤出头用于大面积3D打印。对于AL-CH-NC 4H样品，使用连接到设计辊头的注射器挤出凝胶。高岭土纳米粘土的使用对交联凝胶结构中的孔隙大小及其分布有重大影响。在传统的混合样品中，结构的不规则性在其低倍率图像中很明显的。在打印结构的不同部分，在高倍镜下可以观察到高多孔结构的不规则性。矾（Al）和硅（Si）的EDS图显示了纳米复合凝胶样品表面的纳米粘土的分布。在打印AL-CH-NC 0时，观察到高岭土纳米粘土的作用，它在较低高度上是扭曲的。与传统混合方式相比，使用这种生物粘合剂加工所需时间大大减少。流动模拟研究显示与传统的磁力搅拌器混合过程相比，biopen系统的混合效果更好。对于粘稠的凝胶材料，磁力搅拌器不能有效地混合位于中心区域的颗粒，而Biopen中的逆向旋转螺杆段由于在桶内任何点速度随时间变化，可以较容易混合各组分。通过增加凝胶中的高岭土含量，可以进一步实现高度精度。以上结果证明使用这种先进的biopen挤出头进行纳米复合材料或多组分水凝胶的三维生物打印的显著优势。
5. 基于海藻酸/壳聚糖/高岭土多组份纳米复合生物墨水使用Biowork笔进行大面积3D生物打印
图6 使用MC3T3成骨细胞进行biopen处理大面积3D生物打印样品MTT检测
对于该体系接着使用MC3T3小鼠成骨细胞进行细胞培养，MTT检测结果显示所有样品都显示100%细胞存活率，表明这些纳米复合水凝胶具有细胞支持性和无毒的性质。样品细胞存活率随着天数的增加而增加。本研究中使用的生物墨水生物相容性强成分交联。用于溶解壳聚糖的醋酸量非常少。第0天的活/死结果表明活细胞在整个凝胶基质中均匀分布。7天的研究证实了这些水凝胶的细胞支持性。使用辊头连接的biopen进行三维生物打印结构表明细胞在水凝胶基质中的均匀生长和增殖。在7天内，细胞增殖并几乎覆盖了整个凝胶结构。高岭土对细胞的生长和增殖有明显的影响，从纳米复合水凝胶的细胞密度随着高岭土浓度的增加而逐渐增加可以看出。在MTT试验中观察到的最初的细胞生长迟缓（直到第3天）的结果可能是由于水凝胶中细胞粘附性较差并主要成分缺乏粘附点，以及对新环境的适应问题。细胞的生长和增殖随着高岭土含量的增加而明显改善，H&E和MT染色也证实随着多成分生物墨水中高岭土浓度的增加，细胞外基质形成。在MT染色的样品中，e3和f3样品中分泌的胶质（绿色）数量较高，表明在较高的高岭土纳米粘土数量下，可能会形成骨组织，结构变硬。所有的结果表明，高岭土纳米凝胶对生物墨水打印支架的体外组织再生的影响。
6. 总结与展望
大面积组织工程支架制造需要在每个三维生物打印层中都具有均匀细胞分布和均匀生物力学特性，模仿天然组织，如大面积皮肤、复杂的软骨、分叉的血管等。控制每一层的组合，特别是与3D生物打印中细胞的组合，导致其最终的机械和生物特性。本文开发了一种含有高岭土的多组份纳米复合藻酸盐-壳聚糖水凝胶生物墨水，使用新的先进生物打印头确保细胞在生物墨水中均匀分布。这种具有均匀分布的壳聚糖和高岭土纳米粘土的多组分藻酸盐水凝胶通过生物墨水网络中的聚电解质复合、氢键和离子交联的均匀分布实现卓越结构的稳定。随着高岭土含量的增加，海藻酸盐/壳聚糖水凝胶的机械、生物（体外）和三维挤压生物打印性能得到增强。基于双螺杆笔型设备的便携性确保了它可以作为先进的挤出头（手持式或固定式）用于重建组织工程，而生物墨水与该设备的相结合，更加促进皮肤组织重建的应用。未来在大面积多层用于深层伤口重建体内皮肤组织工程中该体系将会有更大的发展。
文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.carbpol.2023.121046
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