来源： EngineeringForLife
骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是全球儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。虽然确诊为原发性疾病的患者 5 年生存率为 60%-70%，但复发或转移病例的预后明显恶化，生存率降至约 20%。尽管为提高 OS 患者的无病生存率做出了大量努力，包括化疗和手术相结合，但由于肿瘤复发或转移，5 年生存率在过去 30 年中基本保持不变。因此，治疗 OS 迫切需要开发其他有效的治疗策略。免疫疗法通常需要调动患者的免疫反应，这在过去几年中改变了癌症治疗的模式。最近，吲哚胺 2,3-二氧化酶（IDO）因其调节肿瘤微环境中的免疫反应和促进肿瘤进展的特殊功能而成为癌症免疫治疗领域的研究热点。IDO 的过度表达和犬尿氨酸在肿瘤组织中的积累可抑制 CD8+ T 细胞的功能，同时通过与芳基烃受体结合激活调节性 T 细胞。虽然基于 IDO 抑制剂的治疗模式已被证实可获得安全和满意的疗效，但由于肿瘤的免疫原性有限且免疫浸润较低，导致免疫治疗效果不佳，因此很少有 OS 患者能完全从治疗中获益。肿瘤复发和骨组织缺乏整合是骨肉瘤手术治疗中的两大关键问题。因此，高效治疗骨肉瘤迫切需要一种先进的多功能治疗平台，既能消除残余肿瘤细胞，又能促进骨再生。
为了彻底消除肿瘤并同时促进骨再生，来自中国科学院理化技术研究所的孟宪伟、Shi Cheng和Yu Zhang团队将微波响应的沸石咪唑框架8（ZIF-8）纳米材料与一种化疗药物和一种免疫检查点抑制剂整合到3D打印的钛支架上，从而设计出一种智能多功能治疗支架。所构建的支架具有明显的微波热敏性和肿瘤微环境响应特性，可通过微波热疗和化疗诱导肿瘤免疫原性死亡。纳米复合材料支架的异位植入可增强对骨肉瘤的免疫反应，通过协同免疫疗法有效抑制肿瘤复发。在长期植入过程中，ZIF-8 降解释放的锌离子可诱导干细胞的成骨分化。3D打印钛支架的多孔结构和机械性能为骨再生提供了结构性微环境。这项研究为设计用于治疗骨肉瘤的多功能微波响应复合支架提供了一个范例，从而可改进该疾病的治疗策略。相关工作以题为“Multifunctional 3D-printed scaffolds eradiate orthotopic osteosarcoma and promote osteogenesis via microwave thermo-chemotherapy combined with immunotherapy”的文章发表在2023年7月18日的国际知名期刊《Biomaterials》。
1. 创新型研究内容
本研究用一步法合成了ZIF-8@DOX（ZD），先在ZD表面负载DOX，再负载IDO抑制剂，合成ZIF-8@DOX-IDO（ZDI）。然后将 ZDI 与3D打印的钛支架整合形成 TZDI（图 1）。TZDI 的扫描电子显微镜（SEM）图像（图 1b 和 c）显示，通过3D打印获得的支架网络具有精心设计的微观结构和粗糙的表面。放大后，可以观察到大量 ZDI 集成在支架上。透射电子显微镜（TEM）观察到的 ZDI 尺寸约为 110 nm（图 1c），而动态光散射（DLS）检测到的水合颗粒尺寸约为 146 nm（图 1d），这主要是由于 DLS 检测时纳米颗粒表面的水膜造成的。通过 DLS（图 1e）测定的 ZIF-8（Z）、ZD 和 ZDI 的水合粒径分别为 115、135 和 146 nm，证实了它们的成功合成。Z、ZD 和 ZDI 的ζ电位分别为 32.9、11.1 和 3.1 mV（图 1f）。X 射线衍射图样被进一步用来表征合成 ZD 的晶体结构。傅里叶变换红外光谱进一步验证了 ZD 的有效结构。在 ZD 中观察到了 ZIF-8 中咪唑 N-H 在 3136 cm-1 处的伸缩振动和咪唑环在 1141 cm-1 处的伸缩振动。在 ZD 中还发现了 DOX 中位于 1728 cm-1 的 C 双键 O 的伸缩振动和位于 1624 cm-1 的 C 双键 C 的伸缩振动，这表明 ZD 的合成成功。此外，还利用紫外可见光谱（UV-Vis）测量了 Z、DOX、ZD、IDO 和 ZDI 的吸收光谱（图 1g）。在 ZD 和 ZDI 中发现了 DOX 吸收峰，而 IDO 吸收峰仅在 ZDI 中检测到，这进一步证实了 ZD 和 ZDI 的理想结构。能量色散 X 射线光谱分析了 TZDI 的化学成分。结果发现了 Ti、Zn、C、N 和 O 元素的存在，表明 ZDI 与3D打印支架的有效整合。综上所述，这些结果表明，通过将 ZDI 集成到3D打印钛支架表面，成功合成了 TZDI。
图1 基于沸石咪唑酯骨架8（ZIF）的多功能药物递送系统的构建
由于 ZDI 在体外具有优异的 MW 热敏性和药物控释性能，因此有望在治疗 OS 方面实现显著的 MW 热化学疗法。因此，本研究对其抑制 OS 细胞生长的能力进行了评估。首先，评估了 ZDI 的体外抗肿瘤效果（图 2）。采用典型的细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测不同纳米系统（正常对照[NC]、Z、ZD、ZDI、NC + MW、Z + MW [ZM]、ZD + MW [ZDM]和 ZDI + MW [ZDIM]）与小鼠 OS 细胞株 K7M2 共培养 1、3 和 7 d 的细胞活力。结果表明，在同一时间点，与非 MW 组相比，MW 组 K7M2 的存活率明显降低（p < 0.001），这可能是由于 MWA 引起的温度升高所致。封装在纳米系统中的 DOX 可在 MW 照射下释放到细胞内杀死 K7M2，从而导致 ZDM 组和 ZDIM 组 K7M2 的存活率随时间而降低。结果表明，与单独使用 MW 或 ZDI 相比，将 MW 热疗与使用纳米药物的化疗相结合能更有效地杀死 K7M2 癌细胞。
图2 不同纳米复合支架系统的抗肿瘤效果评估
DOX 是一种免疫原性化疗药物，可诱导 ICD，进而刺激 T 细胞抗肿瘤免疫。免疫原性化疗药物可以上调癌细胞和免疫细胞中的 IDO（一种关键的免疫抑制剂），从而阻碍免疫细胞的功能，从而极大地抵消基于免疫原性化疗的癌症疗法的治疗效果。因此，在肿瘤治疗中，DOX 与 IDO 抑制剂的联用具有重要意义，它既能诱导 DOX 的化疗杀伤作用，又能避免 IDO 的免疫抑制作用。癌细胞的 ICD 伴随着一系列特征性变化，包括细胞膜上出现 CRT、HMGB-1 暴露、骨髓树突状细胞（BMDC）活化、分泌 IFN-γ 的 T 细胞的抗肿瘤免疫激活等。因此，这些经典指标可用于确定 ZDI 是否能在体外诱导 ICD。如图 3 所示，CRT 和 HMGB-1 都是经典的免疫原性物质，其功能可调节主要组织相容性复合体（MHC）分子的生物合成，并参与各种炎症反应，其表达/释放的增加可被视为免疫原性增强的标志。与其他组相比，ZDM 组和 ZDIM 组 CRT 和 HMGB-1 的表达明显增加。ZD组和ZDI组中CRT和HMGB-1的增加是由于包封的DOX在MW辐照下部分释放并随后对K7M2细胞产生毒性作用。这些结果证明了纳米药物的MW热疗和化疗的联合作用，其导致肿瘤细胞的免疫性死亡，进而可能促进体内免疫细胞的激活。
图3 不同纳米复合材料支架系统的免疫效应体外评估
体外实验结果证实，MW热化学疗法结合免疫疗法可有效诱导OS细胞的ICD，从而促进抗肿瘤免疫，具有良好的肿瘤治疗效果。接下来，本研究采用Balb/c小鼠股骨OS骨肉瘤模型评估了TZDI支架的体内抗肿瘤疗效。具体实验方案如图 4所示。对 MW 组小鼠进行 MW 照射（1.8 W，5 分钟）。Z、ZD 和 ZDI 组实验小鼠的体温普遍高于单一 MW 组，证实 Z、ZD 和 ZDI 组具有明显的体内 MW 热敏感性。小鼠第0、3、7和14天的照片显示，Ti@ZD + MW（TZDM）组和Ti@ZDI + MW（TZDIM）组的肿瘤比其他组小，在相应时间点采集的股骨原位肿瘤也显示出类似的趋势。其中，TZDIM 组诱导的肿瘤体积缩小最为明显，这表明在 MW 热疗、化疗和免疫疗法的协同作用下，TZDIM 组的抗肿瘤效果最强。14 天后小鼠肿瘤体积和重量的减少也证实了这一结果；TZDIM 组显著抑制了肿瘤的生长。免疫组化分析进一步用于评估肿瘤组织的免疫状态。TZDIM 组小鼠肿瘤组织中 Foxp3 和 IDO 的表达水平在第 14 天时最低，表明由于免疫检查点 IDO 被阻断，免疫抑制作用最弱；而 HMGB-1 和 CD11c 的表达水平最高，表明其可以有效诱导癌细胞的 ICD。
图4 不同纳米复合材料支架系统的体内免疫效应评估
肿瘤引流淋巴结是成熟的 DC 向 T 细胞展示捕获的抗原，从而导致 CD8+ T 细胞功能性激活抗肿瘤免疫的关键位置。本研究对 Balb/c 小鼠肿瘤引流区的淋巴结细胞进行了流式细胞术检测，主要目的是检测 DC 和 CD8+ T 淋巴细胞的浸润情况。具体的流式细胞术方案如图 5 所示。结果显示，在第七天，TZDIM 组 CD3-CD11c+ （图 5b）和 CD3+CD8+ （图 5e）细胞的比例是各治疗组中最高的，这代表了针对肿瘤的局部免疫反应导致了 ICD。此外，还用电子显微镜观察了肿瘤的组织切片。结果显示，TZDM 组和 TZDIM 组 OS 细胞的凋亡和坏死均处于晚期，显示出明显的细胞器损伤。这些研究结果表明，MW 热化学疗法与免疫疗法相结合可诱导癌细胞的 ICD，并有效激活免疫反应，从而有效抑制肿瘤细胞的生长并增强肿瘤细胞的凋亡。
图5 不同纳米复合材料支架系统对免疫细胞活化的影响
考虑到 Zn2+ 固有的成骨特性，在设计工程化多功能复合 3D 打印支架时，本研究考虑了加入 Zn2+ 以增强其成骨特性。因此，本研究初步评估了 ZIF-8 的体外成骨特性（图 6）。通过 PCR 检测的成骨生物标志物碱性磷酸酶（ALP）、Runx2 和骨钙素的表达如图 6c 所示。在第 7 天和第 14 天，ZIF-8 组的成骨基因表达明显高于 NC 组，证实了成骨分化。测定 ALP 活性以评估早期成骨分化。第 7 天，ZIF 组的 ALP 含量略高于 NC 组；但第 14 天，ZIF-8 组的 ALP 含量显著高于 NC 组。茜素红染色和相应的定量分析也显示了类似的结果。这些结果验证了 ZIF-8 可诱导大鼠 BMSCs 产生强烈的成骨反应。此外，BMSCs的细胞骨架染色结果显示，ZIF-8组的细胞骨架蛋白表达量和细胞铺展度明显高于NC组，说明ZIF-8与大鼠BMSCs的相容性更好，更有利于其粘附和生长。这些结果证明，TZDI 支架能为大鼠 BMSCs 的成骨分化提供良好的环境，诱导更强的成骨反应。
图6 ZIF-8 对骨生成的影响
通过将 TZDI 支架植入斯普拉格-道利（SD）大鼠的股骨，本研究评估了 TZDI 支架的体内成骨潜力（图 7）。4 周和 12 周后，收集样本进行显微 CT 扫描和重建分析。在图 7b 中，支架的红色表面是新骨。与钛组相比，TZDIM 组有更多的新骨，这表明负载 ZIF-8 的支架具有更好的生物活性，能诱导新骨生成。此外，BV/TV、Tb-Th、Tb. Sp、Tb-N 和骨矿物质密度进行了定量分析。BV/TV 是骨组织体积与组织总体积之比，代表骨体积分数，BV/TV 的增加直接反映了新骨形成的增强。Tb。Th 代表骨小梁的平均厚度，而 Tb. N 代表相关区域内每毫米骨与非骨交叉的平均数量。Tb. Th和Tb-N的升高表明骨合成比骨分解增强。Tb. Sp 代表骨小梁之间髓质空间的平均宽度。Tb. Sp 的减少表明骨量增加，骨结构增强。结果显示，ZIF 负载支架组的这些指标明显高于 Ti 支架组。血红素和伊红（H&E）染色结果见图 7h，其中黑色部分为支架，红色部分为新骨。在第 4 周和第 12 周，ZIF 负载支架组的新生骨量明显高于 Ti 支架组。用 Masson 三色染色法评估不同组的骨成熟度。结果显示，在第 4 周和第 12 周，TZDI 支架周围红色区域的新骨量高于 Ti 支架组，这也证实了 ZIF-8 支架加速了新骨的成熟速度。
图7 TZDI 纳米复合材料支架对骨生成的体内影响
2. 总结与展望
本研究通过在3D打印钛支架上整合负载有化疗药物和免疫检查点抑制剂的 ZIF-8 纳米材料，设计并制造了一种智能多功能 MW 响应复合支架。这使得高疗效的骨肉瘤矫形治疗和生物活性更强的骨再生成为可能。支架优异的MW热增强特性实现了MW热疗法、免疫疗法和化疗之间的有效协同。重要的是，MW 热疗和化疗通过诱导肿瘤细胞的 ICD 显著增强了适应性免疫反应。结合在肿瘤微环境中释放的 IDO 抑制剂，BMDCs 和 CD8+ T 淋巴细胞可被进一步共同刺激，从而杀死肿瘤细胞。值得注意的是，ZIF-8 释放的 Zn2+ 不仅能促进 BMSCs 的成骨分化，还能增强体内新骨的生成。因此，这种集肿瘤治疗与骨再生于一体的多功能支架为OS的术后治疗提供了一种高效的多功能策略。
文章来源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0142961223002442
| 
京公网安备11010802043351