《Biofabrication》：控制细胞排列的生物3D打印可用于肌腱分化

来源： EngineeringForLife

生物3D打印是一种能够精确、受控地沉积细胞和人工细胞外基质(ECM)以创建功能性组织结构的技术。然而，当前的生物打印方法仍然难以获得机械稳定且独特的细胞形态结构，例如完全对齐的细胞。近日，来自韩国成均馆大学生物医学融合研究所的GeunHyung Kim团队提出了一种新的生物打印方法，可以在细胞中获得增强的机械强度，而不会失去生物活性或单轴排列细胞的地形线索。首先，将含有细胞的dECM溶液填充到聚乳酸(PLA)模具中，然后在溶液中打印不含细胞的高浓度dECM生物墨水（作为机械支撑）（图1）。通过这个过程，打印的支柱可以通过拖曳力诱导浴生物墨水中的细胞对齐，同时，没有细胞的叉指式打印的支柱可以充当机械支撑。

相关研究论文以“Bioprinted hASC-laden cell constructs with mechanically stable and cell alignment cue for tenogenic differentiation”为题于2023年7月25日发表在《Biofabrication》上。

图1 载有hASC的dECM水凝胶的3D打印过程

为了证明这一过程的可行性，作者使用了人类脂肪干细胞(hASC)和源自猪肌腱的基质dECM生物墨水，该生物墨水适合再生肌腱组织，因为定向肌腱细胞促进I型和III型胶原基质的形成和一些关键的肌腱蛋白。使用该生物打印系统制造的细胞构建体表现出可控的机械特性和显着增强的细胞活性，包括单轴排列的细胞形态和肌腱基因表达（图1）。

1. 改进的生物打印策略和dECM生物墨水
为了将所提出的生物打印方法应用于对齐的典型肌肉骨骼组织（肌腱），作者使用源自猪肌腱dECM作为生物墨水。图2A显示了从猪腱中提取t-dECM的过程，还定量测量了天然组织和t-dECM中的DNA含量（图2B）以及生物活性成分弹性蛋白（图2C）、胶原蛋白（图2D）和 GAG（图2E）。结果表明t-dECM中的生物活性成分得到了很好的保留。为了观察t-dECM对肌腱分化的生化作用，使用胶原蛋白作为对照，并使用载有hASC的t-dECM生物墨水。图2G显示肌腱特异性分化（Scx和Tnmd）的免疫荧光图像。图2H还显示了肌腱相关基因的表达（Scx、Tnmd、Col3a1），表明肌腱分化。由于t-dECM的多种肌腱特异性生化成分，与充满细胞的胶原蛋白生物墨水相比，使用tdECM的生物墨水显然诱导了更高的基因表达水平。

图2 tdECM的获取、特性及其生物墨水诱导肌腱能力

2. 打印因素对具有合理细胞排列的混合细胞结构的制造的影响
在所提出的打印过程拖流中，由于打印喷嘴和支柱产生的剪切力，t-dECM分子可以被拉长并沿流动方向排列。打印支柱附近的速度梯度导致负载细胞平行于流动方向排列，从而形成梯度排列的细胞。因此，可以通过调整PLA模具中填充的t-dECM生物墨水的粘度、喷嘴移动速度和打印支柱之间的距离等参数来控制细胞排列（图3）。结果表明，优化后的打印参数可以确保细胞结构表现出良好的排列和机械性能，所得结构表现出优异的细胞排列和高初始细胞活力，表明该过程的安全性。

图3 打印因素对细胞排列的影响

3. 具有对齐细胞和随机分布细胞的充满细胞的构建体的制造

接着，作者展示了具有两种不同细胞形态结构（对齐（AL）和随机（RD））的充满细胞的构建体的制造示意图，用于研究细胞对齐的效果hASC 的细胞活性。图4A和B显示AL和RD构建体的SEM、第1天的活/死以及第3天的鬼笔环肽染色图像，以观察t-dECM形态结构、细胞活力和F-肌动蛋白方向。SEM表明AL结构的原纤维化胶原蛋白与打印方向完全对齐，而在RD中的构建体，原纤维化胶原随机分布。此外，根据活/死图像确定的初始细胞活力显示出非常高的值(>90%)，并且两种结构的值相似（图4C）。作者还评估了Factin的对齐分数，并且AL-构建体在打印方向上表现出比RD-构建体更大的F-肌动蛋白对齐，这表明在AL-构建体上培养的细胞由于印刷过程的细胞对齐方法，构建体比RD构建体上的那些更加对齐（图4D）。

图4 混合结构中对齐细胞(AL)和随机分布细胞(RD)的制造过程示意图及其特点

4. 负载细胞的构建体的体外细胞活性
一般来说，SCX基因在肌腱和韧带的发育和再生中起着至关重要的作用，而TNMD对于这些组织的正确形成和成熟以及维持其机械特性和功能是必需的。因此，作者进一步对其进行了验证。免疫荧光图像表明，AL构建体中的SCX和TNMD比通过打印细胞排列过程获得的RD构建体中更发达（图5A-B）。基因表达检测也是类似的结果，AL构建体比RD构建体具有更高的与肌腱形成相关的基因表达（图5C）。这可能是由于新的打印策略诱导了细胞间相互作用的增加，这对于肌腱分化是必需的。此外，在原位打印和细胞培养10天和21天后测量了打印的混合结构的拉伸性能。如图5D所示，尽管生物墨水中使用了相同的生物墨水成分、印刷的混合结构和细胞数量，但在21天时，AL构建体中观察到的杨氏模量比RD构建体中的杨氏模量大得多。

图5 负载细胞的构建体的细胞检测

5. 混合细胞结构的机械特性
细胞构建体较差的机械性能阻碍了它们在各种组织再生应用中的使用。为了解决这个问题，作者使用不含细胞的甲基丙烯酸酯t-dECMP (t-dECMP-Ma)生物墨水作为混合细胞负载结构中的机械支撑。通过选择合适的光交联和印刷条件表明UV交联过程不会影响t-dECMM中的细胞对齐生物墨水（图6）。在当前的研究中，利用两种生物活性水凝胶来实现对齐的充满细胞的结构，与之前的研究相比，机械性能显着改善。

综上，本文使用改进的生物打印工艺成功制造了具有机械稳定且完全排列的细胞的含细胞结构。该过程包括用充满细胞的生物墨水填充薄模具，并打印生物墨水溶液中不含细胞的高浓度生物墨水。打印参数经过精心选择，以确保细胞结构表现出良好的排列和机械性能。所得结构表现出优异的细胞排列和高初始细胞活力，表明该过程的安全性。该研究所提出的生物打印细胞结构是一种有前途的生物材料，可用于再生具有机械稳定性的对齐组织结构。

文章来源：

https://doi.org/10.1088/1758-5090/ace740