“钛”棒了！3D打印多孔重建棒改善股骨头坏死

来源： EngineeringForLife

股骨头缺血性坏死是一种常见的髋关节疾病。由于股骨头血供的损伤和破坏，骨细胞和骨髓的缺血性坏死导致股骨头结构的改变和塌陷。近日，来自四川大学的周长春研究员及其团队采用3D打印技术制备了一种负载淫羊藿苷（IC）的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒（称为重建棒）。通过有限元分析，验证了重建杆的力学有效性。通过将含淫羊藿苷的硫基透明质酸水凝胶填充到多孔结构中，实现了淫羊藿苷的负载。通过体外细胞实验证实了重建棒的生物学功效，表明其能够增强MC3T3-E1细胞增殖，促进细胞粘附和扩散。通过动物股骨头坏死模型，在体内验证了重建棒的治疗效果。结果表明，重建棒促进了成骨和新生血管，导致骨和种植体之间有效的骨融合。本研究为早期股骨头缺血性坏死的治疗提供了创新的策略。

相关研究内容以“Icariin-loaded 3D-printed porous Ti6Al4V reconstruction rods for the treatment of necrotic femoral heads”为题于2023年8月1日发表在《Acta Biomaterialia》。

图1 多孔Ti6Al4V重建棒的3D模型设计和功能结构表征

优化设计的重建棒的3D模型和实体结构如图1所示。重建棒的长度为30 mm，由前端和后端两部分组成。前端为圆柱形，长20mm，直径5mm。它由一个模拟人类松质骨小梁的多孔金刚石单元组成，孔径为660 μm，孔隙率为70%。后端为实心杆状结构，直径呈梯度变化。其长度为10 mm，初始表面直径为3 mm，并逐渐随5°的梯度增加。重建棒表面覆盖螺纹，螺钉深度1 mm，螺距1.5 mm。在其尾部，设计了与该工具相匹配的槽结构，槽深度为5 mm，槽宽度为0.5-2.3 mm。沿着长轴方向构建了一个穿透重建杆的圆柱形孔，直径为2mm。

图2 各组的有限元模型及等效应力分布网络图

采用有限元分析（FEA）来评价重建棒的机械有效性，并采用Von-Mises等效应力分布作为输出。当负荷值为体重的3倍时，健康组在植入棒前，股骨头表面的等效应力值在0-23.33 MPa范围内，远低于皮质骨的屈服强度（约100 MPa）（图2A）。重建棒的等效应力分布在0~8.97MPa范围内，远低于多孔Ti6Al4V合金的屈服强度（约100 MPa）（图2B）。持续的力有可能导致骨折的进一步伸展，最终导致颈股骨完全断裂，导致整个关节的结构和功能的丧失（图2C）。同时，植入多孔重建棒的等效应力分布在安全范围内（图2D)。重建杆最大等效应力值达到118.50 MPa，超过了多孔Ti6Al4V合金的屈服强度，存在屈服变形和疲劳断裂的风险（图2E）。集中在重建杆上的当量应力也降低到屈服强度以下，以避免屈服和疲劳引起的变形和断裂（图2F)。各组最大等效应力值分布的统计直方图如图2G所示，其结果呈现出相同的趋势。

图3 透明质酸（HA-SH）水凝胶的理化表征

HA-SH通过自交联反应形成，在巯基之间形成二硫键，其化学结构式如图3A所示。用1H NMR验证了巯基的成功接枝，计算出接枝率约为34.5%（图3B）。HA-SH水凝胶通过注射器的挤压成型成定制的文字，反映了其可注射性能（图3C）。各组HA-SH的凝胶化率相似，外观透明、纯度高，差异无统计学意义（图3D）。在膨胀实验中，HA-L和HA-M达到膨胀平衡的速度快于HA-H（图3E），说明在一定范围内，溶质浓度越高，吸水能力越强，同时溶胀比越高，越不容易达到溶胀平衡。在降解实验中，HA-H和HA-M达到降解平衡的速度要快于HA-L（图3F），说明在一定范围内，溶质浓度越低，降解速率越快，抗降解性越差，质量损失比越高。储存模量反映材料的弹性，而损失模量反映材料的粘度，HA-H的粘弹性较高，HA-M和HA-L的粘弹性较低（图3G、H），这说明HA-SH水凝胶的粘弹性与其浓度有关。HA-SH水凝胶的粘度随着剪切频率的增加而降低（图3I)，具有剪切变薄的特性，有利于其注入行为。

图4 重建棒多孔区域各组分的示意图和形态表征

负载淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒基于Ti6Al4V合金，多孔区域的孔隙用载淫羊藿苷的HA-SH水凝胶填充，各部件的示意图如图4A所示。通过3D打印制备的Ti6Al4V合金具有清晰可见、排列整齐的多孔结构（图4B）。HA-SH水凝胶具有不规则的多孔结构，大小分布在数十至数百微米之间，为细胞粘附和组织生长提供空间，以体液为介质实现营养物质和其他物质的分子间转运，有利于药物的缓慢释放（图4C）。IC粉末呈颗粒状或棒状形态，尺寸分布在几百纳米到几十微米之间（图4D）。

图5 在Ti、T3-E1和Ti-HA-IC支架上培养的MC3T31、3、7天细胞活性和增殖

CCK-8检测结果表明，与空白和Ti相比，Ti-HA-IC同时显示出更多的细胞数量（图5A），以及更快的增殖速率（图5B）。Ti-HA-IC表面的细胞数量较多，具有一定的分布规律，勾勒出了支架的多孔结构。共培养第7天，两种支架表面的细胞密度均显著增加，且分布规律相似。相比之下，在Ti-HA-IC表面，细胞数量更多，细胞分布更密集，细胞勾画出的多孔结构更清晰（图5C），证明两种支架均具有细胞相容性。

图6 在Ti和Ti-HA-IC支架上培养的MC3T3-E1在第7天的细胞分布形态

图6A-F为鬼笔毒环肽/DAPI染色下不同密度分布区域细胞的CLSM图像及细胞平均扩散面积的半定量结果，结果均显示Ti-HA-IC支架上的细胞平均扩散面积高于Ti支架。图6G-L为不同表面区域细胞的扫描电镜（SEM）图像以及细胞平均扩散面积的半定量结果，结果显示Ti-HA-IC支架上的细胞平均扩散面积高于Ti支架（白色箭头指向具有代表性的细胞骨架结构）。综上结果，当IC以一定浓度装入支架时，支架呈现细胞相容性，促进MC3T3-E1细胞在支架上的粘附和扩散。

图7 无血管坏死（AVN）的体内和体外建模及其特性研究

在体外实验中，建模后股骨头出现明显的冻伤特征，再升温后较长时间无法恢复，提示存在不可逆的坏死过程（图7A）。在体内实验中，HE染色显示骨清晰，结构致密有序，建模前骨细胞表型正常（图7B）。建模后，骨结构溶解，骨小梁排列紊乱（图7C）。MRI信号异常是骨坏死早期诊断的一个敏感特征，股骨头的高信号和低信号混合，呈“图型”和“双线征”（图7D）。这些结果证实了AVN的发生。X射线显示股骨头在未植入重建棒的情况下，基本表现出加重坏死的趋势；植入重建棒，股骨头的整体形状和生理结构没有明显变化，关节空间清晰，灰色值密度均匀分布，没有明显的不规则变化，没有明显的特点AVN如脆性骨折、增生和崩溃（图7E）。未植入重建棒，术后第16周观察到股骨头出现典型的坏死表现；相比之下，重建棒的股骨头有光泽，形状正常，高度球形（图7F）。

图8 采用Micro-CT观察术后16周股骨头骨量和骨形态

如图8A所示，重建各组股骨头3D模型（包括重建棒），观察宏观形态（黄色），重建各组ROI骨3D模型（红色半球形区域），观察轮廓结构（灰色）。骨体积分数（BV/TV）可以直接反映骨量的变化，结果显示，Ti-HA-IC组的值与健康组的值相近，而Ti组的值略低，对照组的值最低（图8B)。骨表面积密度（BS/TV）可以间接反映骨量的变化，结果显示Ti组的值与健康组值接近，而对照组和Ti-HA-IC组的值明显下降（图8C)。为了进一步分析Ti-HA-IC组中较低的BS/TV值，采集各组中具有代表性的冠状面灰度值图像进行比较，与其他各组相比，Ti-HA-IC组的骨分布较密集，骨小梁间的间隙较小，没有明显的低密度区域（图8D）。同时在每张图像中选择重建棒前端股骨头的中心位置，计算指定区域（红色圆圈中）的平均灰度值，并绘制成折线图，其中Ti-HA-IC基团的数值计算结果最好（图8E）。通过血管造影重建Ti组和Ti-HA-IC组股骨头周围血管的3D模型，Ti-HA-IC组的血管分布密集，数量较多，主血管均较粗，新生毛细血管也较小（图8F）。通过统计值比较，Ti-HA-IC组股骨头周围血管的体积和面积均大于Ti组（图8G）。这说明Ti-HA-IC组IC的持续释放同时促进了骨和血管的修复和再生，血管的形成进一步加速了骨的形成，为AVN提供了协同治疗。综上所述，负载淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒对AVN的修复和治疗效果最好。



图片

图9 采用HE染色和荧光法检测术后第16周时股骨头的新骨形成和骨小梁形态

HE染色结果如图9A、B所示，其中股骨头骨与重建棒接触位置（或同等位置）的代表性图像如图9A所示，重建棒前部位置（或同等位置）的代表性图像见图9B。骨小梁形状较厚，整体分布密度较高，呈块状分布特征。半定量结果显示，各组间骨面积比例有一定程度的差异（图9C）。在Ti组和Ti-HA-IC组中，整体上没有明显的骨丢失，半定量结果显示与健康组相比，对照组骨面积比例明显减少，Ti组无显著差异，Ti-HA-IC组骨面积比例显著增加（图9D）。这些结果表明，如果不进行及时的干预和有效的治疗，股骨头坏死的影响范围将会逐渐增大。通过荧光标记技术比较了对照组和Ti-HA-IC组在新骨生长方面的差异（图9E）。在图像中，钙黄绿素标记的荧光为绿色，盐酸四环素标记为红色，两者的一致性为橙色。在对照组中，两种荧光轨迹重叠很多，说明新骨生长缓慢甚至停止。在Ti-HA-IC组中，两个荧光轨迹明显分离，表明在负载淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒的作用下，新骨仍在生长。

综上所述，本研究开发了一种负载淫羊藿苷的3D打印多孔Ti6Al4V重建棒，为维持股骨头功能结构提供机械支持，释放IC，促进骨修复和再生，实现机体与种植体的有效整合。有限元分析结果表明，植入的重建棒可以转移骨压迫，可以有效地支撑负荷和维持股骨头的结构和功能。体外细胞实验表明，负载IC支架促进了MC3T3- E1细胞的增殖，有利于细胞在支架上的粘附和扩散。体内动物实验结果表明，在AVN早期植入的重建棒既为股骨头提供了机械支持，也为新骨的生长提供了有利的环境，从而形成了有效的界面整合。此外，IC的持续缓慢释放进一步促进了新骨和血管的再生，导致股骨头骨量和骨密度的增加，对坏死的治疗有积极的作用。因此，本研究为AVN的早期治疗提供了一个潜在的策略。


文章来源：
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.07.057