来源： EngineeringForLife
生物组织需要最佳的质量运输来支持代谢平衡。在生理上，这是通过复杂的血管网络实现的，该网络支持氧气和重要代谢物的流入，以及废物的清除和旁分泌信号的循环。如果没有这个庞大的网络，组织就只能依靠扩散运输，而扩散运输的效率通常只有几百微米。因此，在构建工程组织或细胞疗法时，以有利于高效运输的方式设计平台对于支持其在体内长期存活和移植至关重要。大多数细胞植入成功的一个关键参数是形成完整而全面的植入体内血管网络。预血管化，即移植前在体外生成血管结构，可通过吻合加速植入物的灌注。然而，这种技术的可扩展性和整合的简易性阻碍了临床转化。在基于纤维蛋白的血管生成方法中，在血管样结构形成过程中，脆弱的水凝胶基质会发生重塑和降解，导致细胞介导的构建物快速压缩，从而形成致密的毛细血管样结构，网络覆盖效果不佳。
为了解决这些难题，来自美国佛罗里达大学的Cherie L. Stabler团队将血管生成水凝胶嵌入高多孔性、生物稳定性的3D聚二甲基硅氧烷（PDMS）支架中。通过对3D打印模具进行反向铸造，支架呈现出高度互联和可重复的孔隙结构。孔隙大小是通过对装置内血管生成的体内筛选进行优化的。PDMS 框架与血管生成水凝胶的结合大大减少了纤维蛋白在体外的压缩，与单独使用纤维蛋白水凝胶相比，这种结构易于操作，尺寸可预测，表面积增大。从整体上看，PDMS 框架改变了血管的形态发生，网络结构明显增大，密度降低。血管生成蛋白质组学评估显示，添加 PDMS 框架会对时间产生影响，表明细胞增殖和迁移信号发生了改变。这项工作为改进转化前血管网络的生成建立了一个平台，使其具有更大的灵活性，以满足临床规模的工程组织需求。相关工作以题为“3D Printed Elastomeric Biomaterial Mitigates Compaction During In Vitro Vasculogenesis”的文章发表在2023年9月20日的国际顶级期刊《Acta Biomaterialia》。
1. 创新型研究内容
在开发这些高度组织化的硅树脂支架时，可重现的几何特征被认为是体内血管生成和预血管网络形成一致性的关键。因此，本研究选择了熔融沉积建模3D打印技术，因为该技术在微观尺度上可重现几何特征的能力已得到充分证明，可定义明确的孔隙大小。利用建模创建了所需支架几何形状的“负”模。随后用水溶性 PVA 长丝打印出该模型，以便在支架制作完成后移除（图 1A-B）。然后将热固化 PDMS 硅酮注入 PVA 模具的 “正”面空间，在 PVA 模具水溶之前进行交联（图 1C-D）。利用这种反向铸造方法，本研究制造出了两种不同的支架孔隙几何形状：300 微米和 150 微米（图 1 E-F）。此外，还制作了孔径更大的 600 微米支架，但其机械稳定性不足以进行后续的细胞和植入研究。
图1 3D打印硅树脂支架（3DPSS）的制作方法与评价
为了生成所需的前血管网络，HUVEC 和 NHLF 细胞群被包裹在牺牲纤维蛋白水凝胶中。然后将这种水凝胶注入 3DPSS 平台的开放孔中，以确定支架包合是否能在不出现游离水凝胶中通常观察到的剧烈压缩的情况下形成网络（图 2A）。本研究使用立体显微镜观察了游离纤维蛋白水凝胶和 V-3DPSS 在 48 小时内的整体压缩情况，以确定支架包合的益处。仅培养 12 小时后，就观察到有无支持性 3DPSS 的纤维蛋白水凝胶的压缩度发生了明显变化，游离纤维蛋白水凝胶和 V-3DPSS 的表面积相差 5.3 倍（分别为 16 ± 3.5 mm2 和 84.41 ± 3.86 mm2；P < 0.0001）（图 2B、C）。24 小时后，游离纤维蛋白水凝胶的表面积出现了非常显著的下降（P < 0.0001，下降了 2.6 倍），而 V-3DPSS 则保持不变（P = 0.082）。48 小时后，压缩逐渐减弱，因为 V-3DPSS 和游离纤维蛋白水凝胶的表面积在 24 小时和 48 小时之间都没有显著变化。总体而言，虽然 V-3DPSS 在培养 2 天后表面覆盖面积略有变化（6.8%）（P = 0.038），但 V-3DPSS 阻止了游离纤维蛋白水凝胶中出现的高达4.2 倍的减少。
图2 时间水凝胶压缩和网络表面积的成像和量化
研究表明，压缩在血管生成过程中发挥着重要作用，而且很可能是关键作用；因此，细胞组织的时间变化有望成为调节压缩的结果。对自由培养或限制在 V-3DPSS 内的纤维蛋白水凝胶中内皮细胞自我组装的时间变化进行的研究发现，细胞组织发生了明显变化。不出所料，自由纤维蛋白水凝胶中的细胞经历了高度压缩，水凝胶表面积大幅缩小。此外，在早期时间点还能观察到细胞形态的显著差异。具体来说，在第 3 天，两组都出现了主要由单细胞组成的稀疏结构（图 3Ai、3Ci）；然而，与游离纤维蛋白水凝胶相比，V-3DPSS 组（图 3Di）的细胞表现出内皮细胞聚集，多细胞结构的质量更高（图 3Ai）。到了第 5 天，有更多的证据表明，游离纤维蛋白水凝胶（图 3Bii）和 V-3DPSS （图3Dii）中都出现了丝状结构。然而，V-3DPSS 中的细胞仍主要表现为细胞集群模式，并从这些原生球体中延伸出芽状结构。到第 7 天，两组细胞都显示出已建立的相互连接的网络；然而，血管网络密度的视觉差异非常明显，游离纤维蛋白水凝胶与 V-3DPSS 相比，显示出重叠和压缩的分支网络（图 3B iii和图 3D iii）。
图3 血管前网络时间进展成像
为了进一步探究 PDMS 框架对纤维蛋白血管生成的影响，本研究在培养 7 天后使用免疫荧光染色和共聚焦成像技术观察了所生成网络的微观形态。通过肌动蛋白染色可观察到游离纤维蛋白水凝胶含有高度紧密的细胞培养物（图 4A i）。如图所示，大量重叠的细胞给清晰成像带来了挑战，而且信号不会饱和。仅聚焦于 CD 31+ 内皮细胞（图 4A ii），可观察到具有高度连接形态的致密网络。到第 7 天，纯纤维蛋白水凝胶的横截面也显示出一个薄的高度致密的 CD 31+ 网络（图 4B i），并有证据表明存在类似管腔的中空结构（图 4CB ii）。加入 PDMS 框架（V-3DPSS 组）后，网络形态明显不同，整体细胞密度发生了视觉变化（图 4C i）。共培养的形态似乎符合支架的几何形状，填充了 3DPSS 的径向和轴向孔隙。以 CD 31+ 细胞为重点（图 4C ii），在开放的框架内观察到连续的管状结构，结构在 x 和 y 方向上围绕孔缠绕。值得注意的是，V-3DPSS 的横截面尺度和形态发生了明显变化，整体上更厚的血管结构包含更大、更清晰的管腔状结构（图 4D I 和 ii）。
图4 在第 7 天对游离纤维蛋白水凝胶和（V3DPSS）进行免疫荧光染色和共聚焦成像的结果
本研究通过图像分析对这些形态变化进行量化。为了捕捉细胞空间密度的变化，测量了构建体开放空间内细胞覆盖的百分比（%）（图 5Ai）。与游离纤维蛋白水凝胶相比，在顶部平面（x-y）上，V-3DPSS 的 CD 31+ 结构覆盖率总体下降了 29%；但这一差异并不显著（P < 0.122）（图 5A ii）。为了描述培养一周后内皮细胞网络的厚度（z 维度），生成了共聚焦图像的3D投影和深度图。支架框架对整个内皮细胞网络厚度的影响非常明显，与游离纤维蛋白水凝胶相比，V-3DPSS 组增加了 3.6 倍（图 5B ii，P < 0.0001）。为了说明这些差异对网络形态的影响，对网络结构的平均直径、最大直径和最小直径进行了量化（图 5C）。不同培养条件下的图像分析表明，与游离纤维蛋白水凝胶相比，V-3DPSS 组的平均结构直径显著增加（P < 0.0001）（图 5C ii）。此外，V-3DPSS 组每个结构的平均最大直径显著增加（P < 0.0001）（图 5C iii），而平均最小直径则未受到支架包被的显著影响（P = 0.85）（图 5C iv）。这些结果支持肉眼观察到的 V-3DPSS 组网络直径增加和直径多样性增强。
图5 在第 7 天确定整体网络覆盖、网络厚度和结构直径的图像分析结果
有迹象表明，支架的加入弱化了压缩效果，影响了细胞的分布和形态，因此本研究利用广泛的血管生成蛋白质组学分析进一步确定了细胞变化的背景。在第 3 天和第 7 天测量了纯纤维蛋白或 V-3DPSS 的蛋白质阵列。蛋白质阵列结果的汇总热图显示为与纯纤维蛋白第 3 天水平的折叠变化，说明了支架和时间对共培养蛋白质含量的影响（图 6）。与纯纤维蛋白对照组相比，支架的存在仅在第 3 天影响了全局“血管生成”蛋白的表达（P = 0.041；MANOVA），但这种影响在第 7 天消除（P = 0.539；MANOVA）。此外，时间对 V-3DPSS 组是一个重要因素（P = 0.011），但对纯纤维蛋白对照组不是（P = 0.193；MANOVA）。对单个蛋白质组影响的事后比较发现，在测试的组别或时间点之间，没有任何特定蛋白质发生显著变化，这表明蛋白质组受到多种驱动因素的广泛影响。
图6 高通量阵列量化共培养物内蛋白质的时间热图
通过确定各组培养 3 天和 7 天后所测蛋白质的相关系数，本研究进一步确定了血管生成蛋白质组的特征。有了如此庞大的数据集，确定哪些蛋白质在数据集中具有广泛的负相关性，就能大范围地推断出封装细胞的状态以及不同组间随着时间的推移如何进行比较。通过计算第 3 天 V-3DPSS 组中表达的蛋白质的相关系数（图 7A），测得大多数蛋白质之间总体呈正相关，但也有一些关键的例外情况；该数据集中呈负相关的蛋白质包括丝裂蛋白 E1、催乳素、血管内皮生长因子-C 和凝血因子 III。与 V-3DPSS 组相比，对游离纤维蛋白水凝胶进行同样的分析也发现了类似的正相关蛋白质；不过，与数据集负相关的蛋白质群有所不同，特别是 DPPIV、内皮素-1、TIMP-1、凝血酶原-1、血管生成素-1/2 和 FGF-7（图 7C）。对第 7 天相关系数的研究发现，V-3DPSS（图 7B）和游离纤维蛋白水凝胶（图 7D）的蛋白质组概况相似，只有极少数蛋白质与整个数据集呈负相关。V-3DPSS 网络显示 serpin E1、TIMP-1 和 thrombospondin-1 与数据集呈负相关，而游离纤维蛋白水凝胶具有与 V-3DPSS 相似的鉴定群体，即 serpin E1、TIMP-1、thrombospondin-1 和 DPPIV。
图7 显示基于培养条件和时间的不同表达蛋白之间关系的皮尔逊相关矩阵
2. 总结与展望
可重复的3D打印高多孔支架促进了体内血管生成和体外预血管生成。在基于纤维蛋白的血管生成过程中加入3D PDMS 支架，可有效减轻以前认为网络形成所必需的大尺度压缩，而不会影响血管样网络的形成。由此形成的厚构造提供了一种可转移的网络，其网络覆盖范围大大提高，有可能用于基于细胞的组织工程疗法。压缩的减轻对宏观和微观形态都有影响，结构间距、网络厚度和结构直径都发生了明显变化，从而增强了细胞在整个构建体中的空间分布。通过蛋白质组学评估观察到的整体蛋白质含量和蛋白质关系极化的时间变化，凸显了早期共培养动态的改变。这项工作强调了一种生成大规模预血管化网络的方法，具有提高工程组织存活率的转化潜力。未来的研究将侧重于评估支架的加入对预血管网络吻合和与共同移植的治疗细胞整合的影响，以及进一步研究孔径大小对血管生成的作用。
文章来源：https://www.sciencedirect.com/sc ... 23005652?via%3Dihub
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