三维体外血脑屏障模型研究屏障损伤

供稿人：王森、王玲
供稿单位：西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室
来源：中国机械工程学会增材制造技术（3D打印）分会

血脑屏障(BBB)的破坏与多种中枢神经系统疾病有关。体外血脑屏障模型能够研究屏障对外部损伤的反应。近期，苏黎世联邦理工学院的Modena和Wei Wei等人提出了一种基于人源细胞的新型三维BBB平台，包含人脑内皮细胞、原代周细胞和星形胶质细胞，平台集成了透明电极，可用于高分辨率实时监测屏障紧密性。利用该平台证明了氧-葡萄糖剥夺(OGD)条件下可重现缺血损伤的特征：内皮细胞肌动蛋白结构的快速重塑和随后的形态学改变。高分辨率实时成像显示，在OGD应用过程中，内皮层形成了大的肌动蛋白应力纤维束，最终导致细胞收缩和屏障破裂。同时电测量表明，在应力纤维出现之前，屏障电阻迅速下降，这表明在剧烈的形态变化出现之前，屏障功能已经受到损害。通过多种缺血相关评价结果的综合对比证实了该体外血脑屏障平台可概括主要的屏障功能，并可用于研究外部刺激下血脑屏障的快速重构过程。相关论文发表在Advanced Science杂志上。

如图1所示，本研究所开发的三维血脑屏障平台具有以下优势：（1）具备仿生的三维多细胞BBB结构，包括由贴壁的内皮细胞组成血管流体通道，内皮细胞外侧的包含星形胶质细胞和周细胞的3D水凝胶，以模拟脑细胞外基质；（2）通过对血脑屏障平台施加不对称周期性倾斜作用来对血管通道施加准单向流动，以模拟内皮细胞所受的剪切应力，该方法避免了复杂的外接泵管系统，可同时对八个样品同时操作；（3）通过集成透明的氧化铟锡（ITO）电极和铂电极构成四电极跨内皮电阻（TEER）传感器实现对血脑屏障的实时TEER和光学监测。

图1 a）体内血脑屏障示意图；b）血脑屏障芯片示意图；c）血脑屏障芯片平台组成及操作说明

通过将BBB模型暴露于氧糖剥夺（OGD）条件下以模拟缺血性损伤，如图2（a）所示。通过连续记录TEER值并使用活体荧光标记肌动蛋白（SiR-actin）、细胞核（Hoechst）和细胞缺氧指示剂（Image-iT）和高分辨率显微镜来监测屏障变化行为。结果显示在OGD条件下暴露30分钟内出现了强烈的SiR-actin信号所反映的肌动蛋白应力纤维，60分钟后肌动蛋白应力纤维开始聚集，导致ECs收缩，从而导致EC之间连接的损伤和屏障的渗透性的提高。在不同时间点固定细胞并通过免疫荧光监测屏障重构情况，结果表明OGD条件下紧密连接蛋白在细胞连接处的减少，180分钟后屏障完全受损，细胞之间出现孔洞和空隙。持续的TEER监测表明在观察到肌动蛋白聚合前屏障就存在破坏，TEER值在3h内持续下降至最初的88.4%，通透性显著增加了约20倍。

图2 a) 芯片上再现缺血性损伤的实验流程示意图; b) OGD暴露后不同时间点的芯片上细胞屏障成像；（c）OGD暴露后芯片TEER值；(d) OGD暴露3h后4kDa FITC-Dextran渗透性；(e) 正常和OGD条件下内皮细胞基于表达差异

综上所述，该研究建立了一个高度集成、方便操作的BBB模型平台，可以用来重现屏障功能，并研究内皮层在外部损伤后的快速变化。利用BBB平台模拟脑缺血，该模型有助于阐明屏障破坏的机制，为开发脑和BBB相关疾病的治疗药物提供了工具。

参考文献：
Wei W, Cardes F, Hierlemann A, Modena M. 3D In Vitro Blood‐Brain‐Barrier Model for Investigating Barrier Insults[J]. Advanced Science, 2023, 10.