来源： EngineeringForLife
水凝胶作为一种高含水的三维高分子网络，其在结构上模拟细胞外基质，为细胞生长提供“支架”结构，是生物3D打印常用的墨水材料。作为载体材料，水凝胶的性质决定了生物3D打印的成败与质量，其需要具有良好的可打印性并能为细胞生长提供适宜微环境。然而，普通水凝胶的交联网不够均匀且缺乏能量耗散机制使其机械性能较差，无法成为兼顾可打印性及生物相容性的“好用”生物墨水。
近期，美国德州农工大学Akhilesh K. Gaharwar教授团队在Advanced Materials上发表综述文章：Hydrogel BioinkReinforcement for Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies。该文首先介绍生物墨水网络结构如何影响其流变特性、机械强度以及生物学特性，接着重点综述现有生物墨水增强机理及其对生物墨水关键性能的影响，最后给出了几种有前景的下一代生物墨水设计方法。该综述通过深入分析生物墨水“结构-性质-功能”的关系来指导墨水设计，这种自下而上的视角为生物3D打印提供了以材料为中心的生物墨水设计思路。
一、生物墨水的基本特性
首先需要探讨生物墨水的网络结构、流变特性、生物力学和生化特性。这些特性以复杂的方式相互关联，在优化生物墨水性能时必须予以考虑。随着研究深入，这些领域中某些因素已被认为对生物墨水性能至关重要（例如剪切稀化和弹性模量），一些因素仍在评估中（例如剪切恢复和应力松弛）。尽管这些因素在文献中并未得到一致报道，但在物墨水设计时仍应重点研究。
图1 生物墨水的网络结构、流变特性、生物力学及生化特性在打印中的相互作用
1. 生物墨水的网络结构
（1）交联网络
经典的聚合物三维网络通过两种方式形成：a单体溶液的聚合和交联；b现有聚合物交联。两种方法通常都包含密集和稀疏交联区域的随机分布，这种异质性导致受力时局部应力集中，从而在聚合物网络中形成较弱的破坏区域。因此，交联点分布是决定聚合物网络机械性能的关键。交联度增加意味着异构网络变多，这使水凝胶变硬、变脆，而低交联度水凝胶表现为软、韧。
（2）断裂与能量耗散
当前的生物墨水文献通常仅通过一些机械参数来表征凝胶，例如断裂应变、应力以及压缩、拉伸或剪切模量。这些参数固然重要，但仅部分描述了水凝胶的机械性能。对于比较聚合物网络中的总体机械性能，特别有用的参数是断裂能。
水凝胶与其他柔软的聚合物网络具有许多结构相似性，但它们的水合结构导致其机械性能在关键方面有所不同。在所有的软聚合物网络中，固有断裂能取决于裂缝平面处聚合物链的长度、数量和键强度。交联可增加弹性模量和拉伸强度，但会降低断裂能和可延展性。这些因素一起严重限制了常规水凝胶的机械性能。
2. 生物墨水的流变特性和流动模型
（1）牛顿模型
通常在牛顿流体模型中对在打印条件范围内保持一致黏度的生物墨水进行建模，其中剪切速率（γ）等于剪切应力（τ）除以黏度（K）。但是，大多数用于挤出3D打印的生物墨水都是非牛顿流体，它们的表观黏度取决于剪切速率或变形历史。非牛顿效应通常是由于长聚合物链的重新取向和静电相互作用的破坏而引起，这是增强型生物墨水的常见特征。
（2）幂模型
在剪切稀化的生物墨水中，增加剪切速率会迫使聚合物链沿流向对齐，从而降低表观黏度。在较高剪切速率下静电相互作用的破坏也降低了表观黏度。剪切稀化特性对生物打印有益，因为打印过程中剪切应力较低，降低了对细胞的损伤。
模拟剪切稀化行为的最简单方法是利用幂律关系（图1），其中剪切应力（τ）与剪切速率（γ）通过流动行为指数（n）和稠度指数（K）得出。在该模型中，牛顿流体的n = 1，而n值<1则将呈现剪切稀化。幂模型对于在打印条件下的许多生物墨水非常有用。
（3）Herschel Bulkley模型
许多非牛顿生物墨水还表现出黏弹性，其特点是存在一个屈服应力。屈服应力是引发流动所需的最小应力。打印的保真度受屈服应力影响。可以通过在流动轮廓的中心产生活塞流，从而在挤出过程中使包封的细胞免受剪切力的影响，此时剪切力被限制在沿挤出机壁的狭窄区域内。
高屈服应力使生物墨水难以使用，不利于移液和细胞分散操作。屈服应力的变化已在一系列生物墨水中被注意到，其可改善生物墨水的可打印性和细胞存活率。Herschel-Bulkley模型中τ0为屈服应力，低于此值，生物墨水将表现为固体。Herschel-Bulkley流体模型可以准确地描述出剪切稀化和屈服应力的非牛顿流体行为。
（4）Carreau方程
可以使用更复杂的模型来表征生物墨水的行为，如Carreau方程，该方程对于描述非常低和高剪切速率下生物墨水的不同流动行为特别有用。当剪切速率太低而无法克服聚合物链的随机运动方向时，流体被视为具有恒定黏度的牛顿流体，而在中等剪切速率下则被视为幂流体。在较高的剪切速率下，它们再次变为牛顿流体。该模型最近用于表征聚丙交酯微纤维增强藻酸盐生物墨水的流动行为。
（5）现有模型局限性
尽管现有的流动模型可以帮助预测打印过程中的生物墨水行为，但挤出后的剪切恢复变得很重要，但在这些模型中并未考虑在内。
当前的流动模型对于结合实际实验筛选潜在的生物墨水非常有用。最新研究表明，剪切稀化、屈服应力和快速剪切恢复是生物墨水可打印性的关键因素。
3. 生物墨水的生物力学特性
（1）宏观尺度
宏观上，生物3D打印的最终目标是植入人体，这使多数生物墨水难以达到相匹配的械性性能，包括刚度、黏弹性和屈服应力/应变。例如，软组织植入物需要维持与周围组织相似的压缩水平，而不会被破坏或与周围组织分离。在生物打印中，水凝胶在挤出后还必须能够支撑自身，而不会出现明显的塌陷或变形。
（2）细胞尺度
除了宏观尺度，细胞感知尺度的机械性能在组织再生中也起着重要作用。弹性模量（或刚度）会深刻影响封装细胞的行为，例如，间充质干细胞（MSC）的基质刚度依赖性分化。此外，更复杂的黏弹性能也显著引导细胞行为。例如，与纯弹性水凝胶相比，显示出应力松弛的黏弹性水凝胶即使较软也能促进成肌细胞增殖。快速的应力松弛会增加MSC的增殖、扩散和成骨分化。
4. 生物墨水的生理稳定性和生化相互作用
水凝胶的生化环境涉及生物力学性能。例如，细胞可以通过整合素蛋白感知基质的刚度，因此没有整合素结合位点的水凝胶会减少细胞对基质刚度的反应。另外，生物降解性是水凝胶设计中的重要因素。水凝胶将随着时间的推移被再生组织取代，其降解速率应与组织再生速率相匹配。
二、现有生物墨水增强策略
早期3D打印水凝胶只是在机械性能和细胞相容性之间折衷。随着生物3D打印技术的发展，已出现了许多增强型生物墨水材料。他们采用了例如聚合物功能化、超分子增强、纳米复合材料等增强等方式。这些方法通过多种不同渠道改善了水凝胶的机械性能，包括加强交联、使应力分布均匀以及通过牺牲键耗散机械能等。
图2 水凝胶生物墨水增强方式
1. 聚合物功能化及双交联网络
（1）甲基丙烯酸酯功能化
作为最广泛使用的方法之一，甲基丙烯酸酯基团修饰聚合物在其主链上引入双键，这使聚合物可在光引发剂存在下进行光交联。例如，常用的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）在维持明胶许多基本生物活性及温敏性的同时赋予其光交联性。光交联的GelMA在体温下稳定，具有较高的断裂能，更耐降解，并且可以通过选择性曝光进行图案化，用于光固化3D打印。甲基丙烯酸酯化也已应用于多糖，包括透明质酸、壳聚糖、葡聚糖等。
（2）点击化学及其他方法
点击化学反应有高活性并且可在温和的条件下进行的特点。其中最常见的为硫醇-双键点击化学反应。硫醇-双键点击反应为逐步增长反应，其不受氧的抑制且速率很高。这种快速交联特性可通过在挤出的几秒钟之内固化生物墨水来改善可打印性，从而减少结构下垂。
此外，还有用于生物墨水的非光交联剂。例如，酪氨酸酶已被用作光引发剂的替代物，以催化胶原和明胶的交联来增强生物墨水。
2.超分子生物墨水
图3 超分子作用生物墨水机理 （1）主-客体作用
主-客体作用是一种可逆的动态键合方式，最常见的便是β-环糊精与金刚烷间的特异性结合。基于主-客体作用的水凝胶具有剪切稀化及自愈合性能，这有利于挤出打印。尽管主-客作用具有特殊性质，但是水会削弱主-客体间结合力，随着时间的流逝，超分子部分容易受到蠕变和侵蚀的影响。此外，主-客体作用制备的凝胶往往机械性能较差，因此它经常与共价键交联结合使用。
（2）超分子作用
其他类型的超分子作用如氢键、π-π堆积、多肽及DNA类型的超分子水凝胶等。这些类型超分子作用由于其制备过程复杂或机械性能较难满足3D打印需求因而研究较少。
3. 互穿网络
互穿网络（IPN）通过高度异质的水凝胶结构提高了断裂能、韧性和刚度。IPN由两个单独的聚合物网络组成，这些聚合物网络通过共价或离子交联结合在一起（图 4）。
图4 基于互穿网络的生物墨水原理图
（1）离子-共价键纠缠网络
在生物墨水中，最有常见IPN是通过离子-共价键纠缠（ICE）形成的。对于生物打印应用而言，传统的共价键双网络水凝胶制备时间过长。ICE水凝胶由离子交联的刚性聚合物和共价交联的弹性聚合物形成。使用两种不同的交联机制大大减少了形成IPN所需的时间。
（2）双重网络
双重网络为两个相互独立的交联网络，一般为两个网络使用不同交联方式，相互之间的交联不干扰。与任一单独组分网络相比，双网络凝胶的机械性能表现的更为优秀。
互穿网络通过使用脆性牺牲网络与可扩展第二网络相结合，在较宽的损坏区域内分配应力来提高机械性能。由于其交联快速及可恢复的机械性能而被用于生物打印。物理交联聚合物通常也是黏度调节剂，同时改善了可打印性。
4. 纳米复合
图5 纳米复合增强水凝胶生物墨水
由于纳米材料的高比表面积，即使用量很少也可以显著影响水凝胶网络的性能。纳米材料的掺入已被用来向生物墨水添加新的功能，例如增强电导率、刺激响应能力、对细胞行为的控制、改善打印性和机械性。
常用的纳米材料有石墨、碳纳米管、纳米粘土、磁性纳米颗粒、过渡金属二硫属化物和聚合物纳米颗粒等。增强机制可能会根据纳米粒子的大小、形状和表面化学性质而有所不同。通常认为纳米颗粒是通过充当跨越多个聚合物链的可逆交联剂而增强水凝胶的。这样可以使应力有效地分散到整个网络中，并通过破坏纳米粒子与聚合物间的交联而耗散能量。应力分散避免了大范围的裂纹扩展，这种机理已被证明可以提高水凝胶的强度和韧性。
三、下一代生物墨水增强策略
图6 水凝胶生物墨水增强的前沿技术
1. 多组分生物墨水
顾名思义，将多种交联、增强方式组合使用，进而获得具有特殊性能的生物墨水。尽管各种增强方式实现过程不同，但是这些增强策略背后的机制并不是相互排斥的，往往可以与其他方法结合使用。组合使用后可以弥补各自缺点并整合不同增强机制的优势。
2. 滑动环交联生物墨水
单网络水凝胶的弱点之一是非均一的网络结构，这导致应力集中在最短的链上。使用机械互锁的分子，包括滑动环交联体系，如聚轮烷等可有效避免应力集中。这些环动态地跨链滑动，在交联点间均匀地分配应力，从而使水凝胶具有出色的可延展性和高断裂强度。
3. 基于微凝胶的生物墨水
基于水凝胶微球的生物生物墨水格外引人注目。水凝胶微球密集堆积或填充于液体中，微球间的接触面可发生交联反应进而形成大块凝胶。这种方法可控制孔隙率，从而创建高度互连的微孔支架，同时还可为细胞提供特殊的微环境。微球还可包载不同细胞，进而构建多细胞支架。然而，微球可打印性的影响因素仍然知之甚少。包括微球尺寸、多分散性、堆积密度、表面相互作用等。
总结
水凝胶生物墨水的生物学活性与机械性能通常比较矛盾。细胞的生长往往需要稀疏的交联网络以便养分传输，而强度和可打印性则需要更高的聚合物浓度。这些矛盾的需求推动了对更高级水凝胶结构的研究。常规的单网络水凝胶因其不均匀的网络结构而引起的应力集中，这削弱了凝胶的强度。将机能量耗散机制整合到水凝胶结构中可显著提升凝胶机械性能。
随着细胞行为与材料间相互作用的研究，生物墨水增强技术愈发重要。多种组合技术可能具有协同作用，微球生物打印和滑环交联等新方法也正在被积极研究。
参考文献：
[1] Chimene D, Kaunas R, Gaharwar AK. Hydrogel Bioink Reinforcementfor Additive Manufacturing: A Focused Review of Emerging Strategies [J]., 2020,32(1): 1902026.
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