[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]胆囊癌[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] (GBC) [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]是一种恶性肝胆管癌，具有复杂肿瘤微环境[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] (TME) [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]和异质性的特点。传统的[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] GBC 2D [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]培养模型无法忠实地重现[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]TME[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]的特征。近日，[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]榆凯博士开发了一种多细胞[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 3D [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]生物打印人胆囊癌，用于肿瘤微环境和瘤内异质性的体外模拟。该文章名为“[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]Multicellular 3D bioprinted human gallbladder carcinoma for in vitro mimicry of tumor microenvironment and intratumoral heterogeneity”，发表在Biofabrication[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]上。本研究基于三维[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] (3D) [color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]生物打印技术可以建立高通量和高保真度的多细胞[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]模型，设计了一个同心圆柱四培养模型来重建肿瘤组织中细胞的空间分布，其中内部包含[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]细胞，外环包含内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的混合物。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC 3D[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]四培养模型的存活、增殖、生物标志物表达和基因表达谱。苏木精[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]-[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]伊红[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)](HE)[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]和免疫荧光染色验证了[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC 3D[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]四培养模型中[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC/[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]内皮细胞[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]/[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]成纤维细胞[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]/[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]巨噬细胞生物标志物的形态和稳健表达。单细胞[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]RNA[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]测序显示，模型中[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]细胞有两种不同的亚型：腺上皮细胞和鳞状上皮细胞，提示肿瘤内异质性的模拟。对各种体外模型的转录组谱比较分析表明，[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]3D[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]四培养模型中的细胞相互作用和[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]TME[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]将肿瘤细胞的生物学过程重塑为更具侵袭性的表型。[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]GBC 3D[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]四培养模型恢复了[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]TME[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]的特征以及肿[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]瘤内异质性。因此，该模型有望在肿瘤生物学研究和抗肿瘤药物开发中得到应用。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]一、背景介绍
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]胆囊癌 (GBC) 是第五大最常见的消化道肿瘤，总发病率为每100000人3例。它是胆道恶性肿瘤中最常见的癌症，在所有胆囊切除术中占0.2% – 3%，在腹腔镜胆囊切除术中占 0.09% – 2%。值得注意的是，只有30%的患者在术前怀疑患有GBC，其余70%的患者是通过术后病理偶然诊断出来的。GBC具有较高的远处复发率，且尚无公认的最佳辅助治疗方法；此外，研究肿瘤发生、进展和药物开发的机制的方法也十分缺乏。值得注意的是，Nepalet al采用了全面的基因组方法来表征GBC并研究与患者生存相关的分子亚型。这些发现强调了肿瘤微环境(TME)和肿瘤内异质性在GBC发展中起着关键作用。尽管有一项研究旨在通过构建患者来源的GBC类器官来探究GBC致癌过程，但成功率不到15%。因此，迫切需要一种能够模拟TME并重建细胞多样性、细胞外基质(ECM)成分和空间组织的体外模型。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]三维生物打印技术是一种新兴的生物工程技术，将细胞与生物材料混合，精确打印具有复杂空间排列的人造器官和生物医学产品。该技术能够在体外构建具有复杂微结构的多细胞三维组织，有助于模拟肿瘤异质性和微环境。近年来，该技术已广泛应用于生物医学领域。科学家已经利用3D生物打印制造模拟特定结构和功能的体外组织，以进行机制探索和药物开发。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在本研究中的主要目标是利用3D生物打印技术制造具有细胞相互作用和TME的多细胞GBC模型，旨在重现GBC的细胞多样性和肿瘤内异质性。评估了生物打印组织内肿瘤细胞和基质细胞的存活率、增殖和肿瘤相关特征。对2D培养、3D单培养和3D四培养GBC模型进行了基因表达谱比较。预计该模型将在未来的肿瘤生物学研究和抗肿瘤药物开发中得到广泛应用。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 二、材料与方法
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 2.1 概念设计
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 肿瘤的发生、生长和转移都发生在一定的内环境中，即TME。TME是一个由多种成分组成的复杂系统，包括内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞和ECM。TME在肿瘤的生长、进展和耐药性中起着重要作用。肿瘤相关成纤维细胞和浸润的免疫细胞可以通过细胞因子信号传导来调节增殖信号、消除生长抑制、诱导肿瘤血管生成、参与免疫逃逸和抵抗细胞死亡。许多研究表明，肿瘤细胞可以通过分泌血管生成因子来募集内皮细胞，在肿瘤块内形成新生血管网络。这些血管具有很强的通透性，因为肿瘤相关的内皮细胞具有较少的紧密连接，并且与基底膜的附着较少。
[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)] 本研究旨在通过3D生物打印技术建立体外多细胞组分四培养模型，恢复组织中不同细胞的空间分布，准确模拟肿瘤微环境。理想的3D肿瘤模型包括肿瘤细胞构成核心结构，周围的包膜由成纤维细胞组成，结构中的内皮细胞形成微血管供应营养和氧气，免疫细胞散布在血管周围。根据这些原理，我们设计了一个同心圆柱形体外多细胞组分四培养模型(图1(A))。圆柱体内侧包含胆囊癌细胞GBC-SD，外侧环包含内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞的混合物，以模拟包膜组织。我们设计的单丝直径为0.3 mm，内侧和外侧环的线距分别为0.4 mm和0.3 mm。内筒有8个环，外筒有4个环，共堆叠4层，最终高度为1.2mm。
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图 1. 使用基于挤压的3D 生物打印技术制造和表征GBC 3D四培养模型。 (A) 3D四培养模型示意图，其中 GBC-SD 位于内筒中，其他三种基质细胞位于外部空心筒中； (B) 3D四培养模型的生物打印肿瘤组织的代表性照片。比例尺代表5毫米；(C)细胞在3D四培养模型的生物打印肿瘤组织中形成球形结构。这些图中表示了比例尺；(D) 7天的3D四培养模型的HE染色。细胞形成球形结构；(E)组织软化和固定后生物打印组织中不同尺度的照片。
2.1 3D生物打印组织的构建
使用兼容双喷嘴打印的 3D 生物打印机 (ALPHA-CPT1, SUNP BIOTECH) 来制造这些肿瘤组织。将预热的12% (w/v) 明胶和4% (w/v) 海藻酸钠溶液与细胞悬浮液以2:1:2的比例混合，以达到4.8% (w/v) 明胶和0.8% (w/v)海藻酸钠的最终浓度。3D单培养模型的中心为 1.25×107ml−1 GBC-SD细胞，周围是没有细胞成分的生物材料。3D四培养模型具有相同的中心GBC-SD，其周围是1:1:1的HUVEC、分化的THP-1和CCC-ESF-1混合物，总浓度为0.75×107ml−1 GBC-SD细胞。这些组织是通过逐层强制挤压制成的。将生物打印组织收集在35 mm培养皿中，立即用100 mM CaCl2处理3分钟以交联海藻酸钠。然后在3 ml的H-DMEM(补充有 10% FBS、1% 青霉素G和链霉素、40 ng ml−1碱性成纤维细胞生长因子和40 ng ml−1血管内皮生长因子)中培养，每两天更换一次培养基。
三、结果
3.1 3D生物打印组织的构建
GBC由多种不同的恶性肿瘤细胞和支持基质细胞组成。患者之间和肿瘤组织内部存在显著的异质性。此外，不同细胞类型之间复杂的细胞相互作用及其与ECM的相互作用在 GBC的表型多样性、增殖和进展中起着至关重要的作用。为了超越传统的2D培养皿体外模型利用基于挤压的3D生物打印平台构建了3D四培养模型，其中的生物材料模拟了肿瘤ECM。这些模型由GBC细胞的肿瘤核心和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、内皮细胞和成纤维细胞的基质囊组成。
如前所述，这些细胞类型被组装成同心圆柱体，产生体外3D四细胞培养模型，其核心由GBC-SD细胞组成，外环有或没有基质细胞，包括HUVEC、CCC-ESF-1和分化的THP-1。逐层制造后，3D生物打印组织与100 mM CaCl2交联3分钟，以增强模型的稳定性。在宏观尺度上，模型的高度为1.2毫米，内半径和外半径分别为3.15毫米和4.20毫米。3D生物打印组织的ECM由明胶和海藻酸钠水凝胶组成，细胞嵌入其中(图1(A))。明胶是一种由胶原蛋白部分水解而来的蛋白质，与体内的胶原蛋白同源，是一种生物相容性材料，可以模拟GBC组织中ECM的组成。海藻酸钠是一种多糖，当暴露于氯化钙(CaCl2)时，会通过形成海藻酸钙而交联。其生物相容性已得到广泛研究和证实。在优化了为评估模型的逼真度和体外细胞存活率，选择肿瘤核心内GBC细胞的浓度为1.25×107 ml−1，外部基质组织中细胞的浓度为0.75×107 ml−1。外环中内皮细胞、肿瘤相关成纤维细胞和巨噬细胞的比例为1:1:1(图1(A))。
3.2 GBC 3D 四培养模型的特征
GBC 3D四培养模型形状良好，内部边界清晰，这是由于模型内细胞浓度不同所致(图1(B))。将生物打印的组织培养在添加bFGF和VEGF的H-DMEM中，在CaCl2处理3分钟后，每两天更换一次培养基，以保持体外模型的结构完整性。生物3D打印组织内细胞呈球形结构，体外培养过程中细胞半径不断增大(图1(C))。苏木精和伊红(HE)染色显示了这些组织的结构，显示出不同的细胞形态和组织样细胞密度(图1(D))。细胞能够紧密聚集，形成紧密相互作用的球形结构(图1(E))。
采用Calcein-AM/PI染色来评估这些3D生物打印组织的细胞存活率，通过荧光定量确定准确的存活率(图2(A))。对于3D四培养模型和3D单培养模型，在最初7天内存活率保持稳定。体外培养第7天，3D四培养模型的存活率显著高于3D单培养模型。在体外培养过程中监测生物3D打印组织中的总细胞计数(图2(B))。在培养的前3天，3D四培养模型的细胞数量保持稳定，且明显大于3D单培养模型。然而，3D四培养模型的细胞计数在7天减少(3.518×105 vs. 5.366×105, p = 0.03)。相比之下，3D单培养模型的细胞数量保持稳定，并在体外培养过程中逐渐增加。这种差异可能归因于体外培养过程中基质细胞数量的影响以及GBC细胞与基质细胞之间的相互作用。
图2. GBC在3D模型0、3、7、10天时的存活和增殖特征。(A)不同组生物打印组织细胞的活率。通过Calcein-AM/PI染色定量计算活率；(B)不同组生物打印组织细胞总数；(C)通过CCK8分析测量不同组生物打印组织的细胞活力。 并将第0天的平均活力设定为100%。这些图显示了各组之间的显著差异。∗p < 0.05,∗∗p < 0.01；(D)显微镜下三维四培养模型在3,7和10天的细胞活率。绿色表示活细胞，红色表示死细胞。
由于存在多种细胞类型，仅测量活细胞率不能完全描述人工肿瘤组织的生长。采用CCK-8测定法评估组织活力(图2(C))。随着时间的推移，所有3D生物打印组织的活力都略有下降，仅在第3天观察到显著差异。培养7天后，各组织的总活力无显著差异。通过显微镜观察，随着时间的推移，活菌率也略有下降(图2(D))。综上所述，与3D模型相比，3D四培养模型的存活率和细胞活力显著提高随着时间的推移保持稳定，而总细胞计数在7天后发生变化。因此，选择生物打印后第7天作为后续功能实验的时间点。
3.3 多种细胞类型在GBC 3D四培养模型中存活
为了评估 GBC-SD特异性生物标志物的表达，在第7天对GBC 3D四培养模型进行了免疫荧光。一般情况下，3D四培养模型中的GBC-SD细胞对CK7表达呈阳性。此外，GBC-SD 细胞主要保留在内筒中，尤其是在边界处，有几个胆囊癌细胞迁移到外筒中(图3(A))。模型中有Ki-67和CK7双阳性细胞，表明体外培养过程中 GBC-SD 细胞的增殖(图3(B))。水凝胶解聚后，肿瘤细胞在球体结构中显示出密切的相互作用(图3(C))。
图 3. 第7天GBC 3D四培养模型中GBC-SD 的免疫荧光。(A) 3D 生物打印组织的总体远景;(B) 3D生物打印组织的微观视觉;(C)水凝胶解聚后球体结构的照片。对CK7(绿色)和Ki67(红色)进行荧光染色。DAPI (蓝色)是一种细胞核复染剂。
HUVEC作为3D四培养模型中基质细胞的一部分被生物打印到生物打印组织的外筒中。进行CD31免疫荧光染色以评估内皮细胞特异性生物标志物[图4(A)]。肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤的存活、增殖和进展中起着至关重要的作用，显着影响肿瘤组织的生物学特性。在3D 四培养模型中使用了CCC-ESF-1细胞，并使用α-SMA染色跟踪这些成纤维细胞。生物打印组织内的成纤维细胞位于外圆柱体中(图4(B))。为了模拟3D生物打印组织中的复杂 TME，巨噬细胞被认为是免疫细胞的简单表示。THP-1细胞广泛用于体外实验。这些细胞在生物打印前一天被诱导为M0巨噬细胞。CD68染色显示，巨噬细胞主要保留在这些组织的外筒中，少数被极化成CD163表达阳性的M2巨噬细胞(图4(D))。
图 4. 第7天 GBC 3D四培养模型中HUVEC、CCC-ESF-1和THP-1的免疫荧光。(A) CD31 (绿色) 染色用于评估内皮细胞特异性生物标志物。α-SMA (红色) 染色以区分成纤维细胞。DAPI (蓝色) 是一种细胞核复染剂。(B) 对α-SMA 进行荧光染色(红色)。DAPI (蓝色) 是一种细胞核复染剂。(C) 对CD68(绿色)和CD163(红色)进行荧光染色。DAPI (蓝色) 是一种细胞核复染剂。 3.4 单细胞RNA测序揭示了3D四培养模型中的瘤内异质性 为了探索肿瘤细胞的异质性和TME中不同基质细胞的存在，在第7天对GBC 3D四培养模型进行了单细胞测序。经过质量控制和数据清理，从8983个单细胞获得了转录组数据。基于经典生物标志物的表达和t分布随机邻域嵌入(t-SNE)分析，成功鉴定了四种不同的细胞类型：上皮细胞(GBC-SD)、内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞(THP-1)和成纤维细胞(CCC-ESF-1) (图 5(A))。四种不同的细胞类型表现出不同的群体，包括187个巨噬细胞、7076个GBC细胞、689个成纤维细胞和1031个内皮细胞 (图 5(B))。每种细胞类型的典型生物标志物表达水平如图 5(C) 所示。此外，GBC 3D四培养模型中的基质细胞分别概括了癌症相关成纤维细胞、TAM和肿瘤相关内皮细胞的谱系特异性标志物。这些结果表明，体外培养后 GBC-SD 细胞是3D四培养模型的主要成分，但TME仍然包含不同数量的三种肿瘤相关基质细胞类型。 图 5. 通过单细胞RNA测序鉴定的3D四培养模型中的不同细胞类型和瘤内异质性。(A) t-SNE 图在 3D 四培养模型中鉴定了4种细胞类型;(B)显示了3D四培养模型中分配的4种细胞类型的数量;(C)小提琴图显示了4种不同细胞类型中经典生物标志物的表达水平;(D) GBC-SD 细胞的 t-SNE 图鉴定了2种主要细胞亚型，包括鳞状上皮细胞和腺上皮细胞;(E) 腺上皮生物标志物(CDH1 和 TFF1) 的t-SNE 图，由基因表达水平的标准化强度着色;(F) 鳞状上皮生物标志物(KRT19、CD24、KRT5和KRT15) 的t-SNE 图，由基因表达水平的标准化强度着色;(G) 小提琴图显示了(D)中鉴定的2个不同细胞簇中经典生物标志物的表达水平;(H) GSVA 图显示了鳞状上皮细胞和腺上皮细胞的标志性基因集富集结果的不同术语。显示了使用robust rank aggregation(左图)以及 AUCell、UCell、singscore 和 ssgsea(右图)的富集分析结果。
起源于胆囊粘膜上皮细胞的GBC大致可分为两种亚型：胆囊腺癌和腺鳞状细胞癌。通过分析经典上皮生物标志物的表达，进一步将3D四培养模型中的GBC-SD细胞分为两个基因表达谱显着不同的细胞簇(图 5(D))。在EPCAM+/CDH1+上皮细胞中，角蛋白(包括 KRT19、KRT5 和 KRT15)表达较高的一组被注释为鳞状上皮细胞，而另一组分泌蛋白表达较高，以三叶因子(TFF1) 表达为特征，被指定为腺上皮细胞(图5(E)-(G)).鳞状上皮细胞主要存在于 GBC 的腺鳞状细胞癌亚型中，而腺上皮细胞主要存在于胆囊腺癌中。然而，这两个上皮细胞簇的分布也表现出显著的患者间和瘤内异质性。因此，3D四培养模型有效地概括了瘤内异质性，这可能是由模型内GBC-SD细胞的不同空间分布以及与基质细胞的相互作用决定的。 为了进一步研究生物打印组织的瘤内异质性，对GBC细胞的两个细胞簇进行了 irGSEA。采用了基于单样本基因表达谱的基因集富集分析方法，包括AUCell、UCell、singscore和ssGSEA。通过不同结果的RRA，在两个上皮细胞簇中鉴定了显着丰富的标志。在鳞状上皮细胞簇中，血管生成、上皮间充质转化、刺猬信号传导、缺氧、TGF-β信号传导和通过NF-κB的TNF-α信号传导等10个标志物被富集和上调。在腺上皮细胞簇中，氧化磷酸化的标志物富集并上调 (图5(H))。在腺上皮细胞簇中，AUCell 基因集富集分析鉴定了33个下调的基因集和12个上调的基因集;UCell 基因集富集分析确定了39个下调的基因集和9个上调的基因集;SingScore 基因集富集分析确定了50个下调的基因集;ssGSEA鉴定了39个下调的基因集和8个上调的基因集(图5(H))。
3.5 基因表达谱随细胞组成和组织结构而变化 为了评估和比较这些生物打印组织中的 TME，在第7天对2D培养的GBC细胞、3D培养的GBC细胞和3D四培养的GBC细胞进行了RNA测序。对于3D四培养模型，最初在显微镜下从中央核心区域分离出由GBC-SD细胞组成的肿瘤组织。降解3D生物打印组织后，从多个模型中分离出总RNA，用于后续测序。评估了这些样本的RNA测序质量，超过90%的基因错误率低于0.01%。通过DESeq2鉴定校正P值< 0.05和log2 (倍数变化[FC])⩾2.5的基因。在基于这些基因生成火山图之后，满足−log10 (Padj)⩾17和|log2(倍数变化[FC])|⩾2.5被认为是DEG。对每组的生物重复进行测序，根据主成分分析 (PCA)，同一组的样品表现出优异的重复性。PCA和DEGs的热图都揭示了3D四培养模型、3D单一培养模型和2D培养模型之间不同的基因表达谱(图6(A)和(B))。
图 6. 3D四培养模型中的肿瘤细胞表现出不同的基因表达谱。(A)来自不同模型样本的主成分分析。y 轴表示主成分 2，其方差比例为30.51%。下面的 x 轴表示主成分1，其方差比例为45.96%。样本在二维平面上表示为点，它们之间的距离显示了差异;(B) 显示3D四培养模型、3D单一培养模型和2D培养模型中DEGs 基因表达水平的热图;(C) 3D 四培养模型与 3D 单一培养模型的火山图上的 DEG 比较。y 轴表示显著性，即 log10(padjusted)。x 轴表示对数转换的折叠变化 (FC)，即log2FC。显著上调的DEG以红色显示。下调的DEG以蓝色显示，而没有显著变化的基因以黑色显示;(D)与3D单一培养模型的基因本体论(GO)数据库对DEGs的功能注释。左侧的y轴表示不同的GO术语。下面的x轴表示单个通路中的DEG数量。不同的 GO术语按GO注释的类别着色。图 中说明了p调整后< 0.05的为显著富集的GO通路;(E) 3D四培养模型和3D单一培养模型之间细胞对趋化因子通路反应的基因集富集分析(GSEA)。q= 0.03;(F)参与3D四培养模型和3D单一培养模型之间免疫反应通路的细胞活化的GSEA。q= 0.03;(G) 3D四培养模型和3D单一培养模型之间细胞迁移途径的正调控的GSEA。q= 0.04。DEGs代表差异表达基因。
3.5.1 3D 生物打印组织中的肿瘤细胞显示出不同的基因表达谱
与3D单一培养模型相比，在3D四培养模型中共鉴定出582个DEG，包括514个上调基因和68个下调基因(图6(C))。使用基因本体论(GO) 数据库对这些DEGs进行注释，以评估它们的功能。GO注释显示，富集的GO项主要集中在生物过程类别中(图6(D))。值得注意的是，3D四培养模型的特征是细胞对趋化因子的反应、参与免疫反应的细胞活化和细胞迁移的正调节(图6(E)–(G))。GO富集分析结果表明，3D四培养模型中的3种不同基质细胞类型对GBC细胞有显著影响，突出了肿瘤-基质细胞相互作用对肿瘤组织生物学特性的影响。此外，将3D四培养模型与传统的2D培养模型进行了比较，3D四培养模型中GBC细胞的基因表达谱表现出显着改变。有464个上调的DEG和113个下调的DEG [图7(A)]。与上述结果一致，大多数富集的GO术语被归类为生物过程(图7(B))。具体来说，3D四培养模型在与细胞外结构组织、细胞粘附和细胞因子介导的信号通路相关的过程中表现出显著富集(图 7(C)–(E))。此外，对TME相关的GO术语进行了GSVA，例如免疫反应、ECM组织和对缺氧的反应，所有这些术语在3D四培养模型中的富集评分都显著高于3D单培养和 2D培养。总之，3D四培养模型表现出不同的基因表达谱，表明与三种基质细胞类型共培养比3D单一培养和2D培养更好的TME复制。
图 7.分析3D四培养物与2D培养物以及3D单培养物与2D培养物的DEG。(A) 3D四培养模型与2D 培养模型的火山图上的DEG s;(B) 3D 四培养模型的GO数据库与2D培养模型的DEGs功能注释的比较;(C) 3D四培养模型和2D培养模型之间细胞外结构组织通路的基因集富集分析(GSEA)。q = 0.005;(D) 3D四培养模型和2D培养模型之间细胞-细胞粘附途径的 GSEA。q = 0.005;(E) 3D四培养模型和 2D 培养模型之间细胞因子介导的信号通路的 GSEA。q = 0.01;(F) 3D单一培养模型与2D培养模型的火山图上的DEG比较;(G) 3D单一培养模型的GO 数据库与2D 培养模型的DEGs功能注释;(H) 3D单一培养模型和2D 培养模型之间细胞-细胞粘附途径的 GSEA。q= 0.007;(I) 3D单一培养模型和2D培养模型之间细胞外基质组织通路的GSEA。q = 0.01;(J) 3D单一培养模型和2D培养模型之间的细胞外结构组织通路的GSEA。q= 0.02。DEGs代表差异表达基因。
进一步比较了3D单一培养模型和传统2D培养系统之间的转录差异。在该分析中，当将3D单一培养模型与2D培养模型进行比较时，发现540个上调的DEGs和1527个下调的 DEGs(图 7(F))。超过一半的富集GO术语位于生物过程类别中(图 7(G))。3D单一培养模型的转录谱显示细胞间粘附、ECM 组织和细胞外结构组织等过程的富集(图 7(H)–(J))。这些结果进一步证实，3D生物打印显着增强了细胞-ECM相互作用，部分概括了体内的TME。
3.5.2. 3D生物打印模型模拟复杂的细胞相互作用
肿瘤细胞和基质细胞之间的相互作用以及细胞-ECM相互作用共同塑造了肿瘤组织的生物行为，每个成分都会影响其他成分。为了了解这些复杂的相互作用，研究了3D四培养模型和2D培养模型之间的DEG，以及3D四培养模型和3D单一培养模型之间的DEG，重点关注交叉的DEG(图 8(A))。该分析提供了与基质细胞共培养对肿瘤组织生物学特性影响的更全面视图。在选定的122个基因集中，GO富集分析显示，大多数富集的GO术语集中在生物过程类别中，包括与细胞外结构组织、上皮细胞迁移和钙离子隔离调节相关的过程(图 8(B))。这些结果表明，肿瘤细胞和基质细胞之间的相互作用与肿瘤迁移和侵袭有关，并且这些相互作用可以在3D四培养模型中概括。此外，比较了3D单一培养模型和2D培养模型之间的DEG，以及3D四培养模型和2D培养模型之间的 DEGs(图 8(C))。两组DEG中的286个常见基因揭示了3D生物打印组织中ECM的存在所诱导的改变。3D 生物打印组织中的GBC细胞表现出与细胞生长调节、细胞-基质粘附和内质网腔相关的GO术语的富集[图 8(D)]。上述结果表明，3D四培养系统中基质细胞和ECM成分的存在显着影响GBC细胞中的各种生物过程和细胞成分。因此，对于与肿瘤生物学相关的研究，例如机制探索和抗肿瘤药物开发，选择包含各种基质细胞和ECM成分的模型至关重要。
图 8. 3D 生物打印组织模拟复杂的细胞相互作用，并显示与不良预后相关的转录特征。(A) 3D四培养模型与2D培养模型的DEG以及3D四培养模型与3D单一培养模型的DEG之间的维恩分析。图中说明了基因的数量;(B)GO数据库在A中识别的常见DEG的功能注释;(C) 3D单一培养模型与2D培养模型的DEGs 以及3D四培养模型与2D培养模型的DEG之间的维恩分析。图中说明了基因的数量;(D) GO数据库在C中识别的常见DEG的函数注释;(E)基于3D四培养模型(与3D单培养模型相比)的基因表达特征，对GDC泛癌 (PANCAN) 队列患者进行Kaplan-Meier生存分析。根据特征表达评分，将患者分为“高3D四培养特征”组 (n = 1495) 或“低3D四培养特征” 组 (n = 10011)。采用对数秩分析进行分析，P < 0.0001;(F) 基于 3D 四培养模型(与 2D 培养模型相比)的基因表达特征对 PANCAN 队列患者进行 Kaplan-Meier 生存分析。根据特征表达评分，将患者分为“高 3D 四培养特征”组 (n = 1391) 或“低 3D 四培养特征”组 (n = 10115)。P < 0.0001;(G) 基于 3D 培养模型(与 2D 培养模型相比)的基因表达特征对 PANCAN 队列患者进行 Kaplan-Meier 生存分析。根据特征表达评分将患者分为“高 3D 培养特征”组 (n = 5184) 或“低 3D 培养特征”组 (n = 6322)。P < 0.0001。
此外，还使用CCC-ESF-1、分化的THP-1和HUVEC对同质3D生物打印组织进行了RNA测序。差异分析显示，与传统2D系统相比，3D生物打印组织中的基质细胞表现出显着改变的基因表达谱。具体来说，对于HUVEC，当将3D生物打印组织与2D培养模型进行比较时，有19个上调的DEGs和32个下调的DEGs。对于分化的THP-1，当将3D生物打印组织与2D培养模型进行比较时，有122个DEGs上调，66个DEGs下调。对于CCC-ESF-1，当将3D生物打印组织与2D 培养模型进行比较时，有249个DEGs上调，424个DEGs下调。
3.5.3. 3D 生物打印组织中的肿瘤细胞表现出与不良预后相关的转录特征
为了验证 GBC 3D 四培养模型的临床相关性，利用来自UCSC Xena的GDC PANCAN 队列进行生存分析。最初，使用GSVA评估了PANCAN队列中每个样本的特征评分。然后，我们将签名评分高的患者与签名评分低的患者的预后进行了比较。与对照组相比，目标模型(3D 四培养模型或3D单一培养模型)中前50个上调的基因被指定为GSVA中感兴趣的基因集。表现出较高 GSVA 评分的患者被归类为具有“高签名评分”。与3D单一培养模型相比，对于3D四培养模型中上调的基因特征，3D 四培养特征评分高的患者预后明显更差(p< 0.0001) (图 8(E))。同样，与2D培养模型相比，对于3D四培养模型中上调的基因特征，3D四培养特征评分高的患者预后明显较差(p< 0.0001) (图 8(F))。此外，比较了3D单一培养特征对患者预后的影响。与2D培养模型相比，对于3D单一培养模型中上调的基因特征，3D培养特征评分高的患者预后明显较差 (p < 0.0001)(图 8(G))。
此外，还利用了来自公共数据库 Genomics of Drug Sensitivity in Cancer的数据进行药物敏感性模拟。集成电路50比较了3D Tetra培养物与3D单一培养物、3D Tetra 培养物与2D 培养物以及3D单一培养物与2D培养物特征高表达和低表达的细胞系之间的GBC药物值。在所有3项比较中，特征的高表达与显著较高的IC相关50值 (p < 0.001)。这些结果进一步证实了肿瘤细胞和基质细胞之间的相互作用，以及GBC 3D 四培养模型中的细胞-ECM相互作用，可能会影响与肿瘤侵袭、治疗耐药相关的生物过程和特征，并最终导致较差的预后。因此，GBC 3D四培养模型可以作为GBC相关研究的更现实和临床相关的平台。
四、讨论
本研究首次成功构建3D生物打印的人类多细胞胆管癌组织，该组织在体外模拟TME方面具有巨大的潜力。在设计这种复杂的组织结构时，充分考虑了人胆管癌中的肿瘤-基质比。肿瘤-基质比是指肿瘤组织中肿瘤细胞与基质细胞的比例，其截断值由Mesker等提出为50%。李等根据肿瘤-基质比将51例胆囊癌患者分为两组。基质比例低于50%的患者定义为基质贫乏组。基质比例大于50%的患者定义为基质丰富组。作者发现，肿瘤基质丰富的胆管癌患者总体预后不良。根据这些研究的结果，初步将3D四培养模型中的基质细胞比例设定为约30%。
在确定模型中的间质细胞类型时发现内皮细胞是TME中的关键细胞成分。肿瘤环境中最突出的免疫细胞类型是巨噬细胞。TAM是肿瘤基质中数量最多的细胞群，约占细胞总数的30%–50%。成纤维细胞是肿瘤组织中的主要基质细胞。在某些肿瘤类型中，肿瘤相关成纤维细胞可能存在于约50%的肿瘤基质中。因此，选择内皮细胞、巨噬细胞和成纤维细胞作为肿瘤模型的主要基质细胞。
根据不同的细胞类型及其分布情况，分别生物打印了3D四培养模型和3D单联培养模型，对比了不同时间点两组细胞数量、细胞存活率和细胞活力，发现只有3D单联培养模型的细胞数量持续增加，而另一组细胞数量则在一段时间内适度下降后又恢复到初始水平。造成这种现象的原因可能是在计算细胞数量时无法区分每种细胞的具体类型。在四培养条件下，内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞没有以特定的比例存活，降低了细胞总数。在后期，肿瘤细胞的增殖弥补了这些细胞数量的减少
本研究构建的3D生物打印组织中的细胞存活率随着培养时间的增加不断降低而后恢复到75%左右，该值低于网格肝癌组织中的细胞存活率(约90%)，但与Amann等构建的3D细胞培养体系中非小细胞肺癌细胞与基质细胞共培养模型的细胞存活率(60%~80%)相近，造成该结果的原因可能是本研究采用的同心环结构缺乏3D生物打印组织内的通道，从而导致中枢缺氧。缺氧是大多数实体肿瘤的共同显著特征，也被发现与胆囊癌预后不良有关。在模型中还发现缺氧相关特征的上调，表明TME恢复得更好。此外，在3D四培养模型中观察细胞增殖能力时，发现大量GBC-SD细胞呈Ki-67阳性。在多细胞组织中，成纤维细胞和巨噬细胞可以被标记。加入VEGF和bFGF后，内皮细胞中CD31表达强烈。这表明多细胞四培养方案是成功的，各种细胞均存活。
通过单细胞RNA测序，成功在3D四培养模型中鉴定了上皮细胞(GBC-SD细胞)、内皮细胞(HUVEC)、巨噬细胞(分化的THP-1)和成纤维细胞(CCC-ESF-1)。这四种细胞类型的相对比例与最初的设计有所不同，可能是因为GBC细胞在体外培养过程中会增殖，而某些基质细胞在长期四培养中可能面临的挑战，例如PMA诱导的THP-1分化会阻止增殖。因此，在GBC 3D四培养模型中，第7天分化的THP-1细胞的相对百分比较低。利用3D四培养模型，鉴定了两种不同的GBC细胞簇，它们具有明显不同的基因表达谱和不同的标志富集特征。这两簇被描述为鳞状上皮细胞和腺上皮细胞。这些结果表明，在多细胞四培养系统中，肿瘤细胞表现出明显的肿瘤内异质性。这表明3D四培养模型有效地复制了肿瘤内细胞的多样性和异质性，这可能归因于模型内GBC-SD 细胞的差异空间排列及其与基质细胞以及ECM的相互作用。
为了进一步评估这些生物打印组织中的TME，对来自3D四培养模型、3D单元培养模型和2D模型的几组不同细胞类型的RNA进行了测序。这三种模型中的GBC细胞表现出不同的基因表达谱。GSVA结果证实，在3D四培养模型中，TME内的机械生态位、代谢微环境、免疫微环境和应激适应微环境对肿瘤进展有显著影响。对DEG的进一步探索表明，肿瘤细胞和基质细胞之间的细胞相互作用可能与细胞外结构组织、上皮细胞迁移和钙离子隔离调节相关的途径有关。同时，3D生物打印引入的肿瘤细胞-ECM相互作用可能与GO术语有关，例如调节细胞生长、细胞-基质粘附和内质网腔。综上所述，这些发现表明3D四培养模型可能比其他体外模型代表更恶性和临床相关的表型。利用PANCAN队列的生存分析进一步证实，3D四培养特征评分高的患者预后较差。
越来越多的研究强调了细胞间相互作用以及细胞-ECM相互作用在肿瘤研究中的重要性。传统的2D培养和动物模型存在局限性。因此，该领域迫切需要更好的体外肿瘤模型。
五、结论
本研究成功构建了体外可长期存活的多细胞成分的3D生物打印胆囊癌组织。首先，我们的GBC 3D四培养模型是一种具有空间异质性的体外模型，由GBC细胞核心和非肿瘤性肿瘤周围组织组成。该模型可以更精确地表示TME，并可作为强大的研究平台。另一个优势是，应用3D生物打印技术构建这些模型具有显著的效率和令人满意的可重复性，使模型中的各种细胞类型能够在保持其生物功能的同时承受长时间的体外培养。此外，GBC细胞(被鉴定为鳞状上皮细胞和腺上皮细胞)在3D四培养模型中表现出明显的肿瘤内异质性。此外，基因表达谱显示，与传统的体外模型相比，3D四培养模型更好地刺激了肿瘤组织的生物学行为，并提示了更恶性的肿瘤表型。该模型有望在未来肿瘤生物学研究和抗肿瘤药物开发中得到广泛应用。
六、参考文献
Jin Y, Zhang J, Xing J, Li Y, Yang H, Ouyang L, Fang Z, Sun L, Jin B, Huang P, Yang H, Du S, Sang X, Mao Y. Multicellular 3D bioprinted human gallbladder carcinoma forin vitromimicry of tumor microenvironment and intratumoral heterogeneity. Biofabrication. 2024 Aug 22;16(4). doi: 10.1088/1758-5090/ad6d8c. PMID: 39121870.
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