来源： EngineeringForLife
骨折是一种常见的外伤性骨骼损伤，具有重要的临床意义，严重影响患者的生命。传统的治疗方法，在某些情况下可以取得良好的效果。然而，在复杂骨折或长时间愈合过程的治疗中，挑战和局限性仍然存在。
近期，同济大学医学院陈爱民主任医师联合北部战区总医院海金医师和上海长征医院朱磊医师团队通过构建GBMA@BMSCs水凝胶（GBMA，明胶甲基丙烯酰骨基质酸酐；BMSC，骨髓间充质干细胞），探讨缺氧诱导因子1α（Hif1a）基因在骨折愈合过程中对软骨基质的调节作用，同时探讨该水凝胶在骨折治疗中的潜在价值。
相关研究成果以“Enhancing Fracture Healing with 3D Bioprinted Hif1a-Overexpressing BMSCs Hydrogel: A Novel Approach to Accelerated Bone Repair”为题于2024年11月24日发表在《Advanced Healthcare Materials》上。
1. 制备适合生物培养的光交联BMA水凝胶基质材料
脱细胞骨组织材料的制造过程如图1A所示。脱细胞骨组织材料分别用Triton X100和DNase I处理12和24 h。H&E、Masson染色及纤维连接蛋白和胶原蛋白的免疫染色等结果表明triton X100和DNase I处理12h适合骨组织脱细胞化（图1B）。DNA含量下降超过96%（图1C），硫酸酸化GAG（sGAG）含量（图1D）和胶原蛋白含量（图1E）在脱细胞组织中与原始组织中相同。实时、原位光流分析揭示了BMA剪切存储模量的时间演变，反映了材料在不同剪切条件下的机械稳定性（图1F）。此外，对不同交联时间点BMA弹性模量的分析表明，随着交联时间的延长，BMA弹性模量显著增加，表明材料的力学性能随着交联时间的延长而增强（图1G）。
BMA的SEM图像显示典型的纤维结构，类似于I型胶原（图1H）。与甲基丙烯酸酯基团交联后，BMA表现出共价交联水凝胶中常见的多孔微观结构，随着交联程度的增加，孔径逐渐减小。用成功分离的骨髓间充质干细胞与BMA水凝胶共培养进行的细胞活力测定显示，即使在所有样品中至少培养5天后，细胞活力也保持在较高水平（图1I）。在第5天，交联15、30和45 s的骨髓间充质干细胞的平均存活率分别为92%、94%和91%（图1J），证实了BMA材料良好的细胞相容性。这些结果表明成功制备了一种生物可培养的光交联BMA水凝胶基质材料。
图1 BMA基材料的制备与表征
2. 复合水凝胶的制备及细胞生物打印性能研究
为了既能实现3D打印成型，又能保证机械性能和细胞活力，研究者选择将合成的BMA与商业GelMA结合起来。然后研究了复合水凝胶的3D打印成形性、机械性能和细胞活力（图2A）。交联前后生物墨水的光学图像显示，随着BMA浓度的增加，粘度增加，透明度降低。与BMA混合后，水凝胶的内部形貌变得粗糙（图2B）。流变显示，所有复合凝胶都有剪切变薄的行为，BMA浓度越高，粘度越高，且水凝胶具有良好的稳定性（图2C-E）。此外，BMA的加入显著提高了复合凝胶的压缩模量（图2F）。交联后，复合凝胶的膨胀率与BMA含量成反比降低（图2G），表明BMA浓度越高，交联点越密，凝胶孔隙率越低，与SEM结果一致（图2B）。降解实验表明，随着BMA的加入，降解速度加快（图2H）。水接触角测试表明，水接触角随着BMA含量的增加而减小（图2I）。BMA的加入增强了细胞的流动性（图2J），活/死细胞实验表明紫外线光交联是一种细胞友好的过程，不会导致显著的细胞死亡（图2K-L）。
图2 生物墨水的制备与表征
3. 3D打印GBMA@BMSCs水凝胶增强大鼠骨折愈合
为了研究3D打印GBMA@BMSCs水凝胶在大鼠骨折愈合中的作用，建立了股骨中轴骨折内固定模型，观察水凝胶在愈合过程中的治疗效果（图3A-C）。动态观察骨折部位，GBMA@BMSCs组促进骨痂和骨形成，在骨折部位建立坚固的桥接，从而产生优越的治疗效果（图3D）。术后第14天的MicroCT 3D重建显示，GelMA/BMSCs和GBMA@BMSCs水凝胶治疗组骨痂形成更多，骨折间隙更小（图3E），骨体积/总体积（BV/TV）和骨小梁厚度（Tb.Th）均显著增加，其中GBMA@BMSCs水凝胶治疗组效果更为突出（图3F）。染色结果显示，GelMA/BMSCs和GBMA@BMSCs水凝胶治疗组骨面积增大，软骨面积减小（图3G-I）。生物力学分析表明，GelMA/BMSCs和GBMA@BMSCs水凝胶治疗促进骨折愈合，GBMA@BMSCs水凝胶治疗组富含脱细胞基质，提供骨相关物质基础，骨折修复治疗效果比GelMA/BMSCs水凝胶组更显著（图3J-L）。
图3 植入GBMA@BMSCs水凝胶对大鼠骨折愈合过程的影响
4. GelMA/BMSCs水凝胶T移植对大鼠骨折愈合的机制研究：Hif1a是关键的调节因子
随后，研究者对GelMA/BMSCs水凝胶治疗的骨折大鼠进行采样，进行转录组测序，并与正常大鼠进行比较，分析参与骨折愈合的关键基因（图4）。结果显示，Hif1a表达在骨折愈合阶段显著上调，在骨痂形成成骨期达到峰值，在骨折愈合后期下降。说明在GelMA/BMSCs水凝胶移植骨折愈合过程中，Hif1a可能是一个关键因素。
图4 骨折愈合过程生物信息学分析的关键因素
5. Hif1a在缺氧条件下增强骨髓间充质干细胞活性，促进骨髓间充质干细胞成软骨分化
骨折愈合最初发生在缺氧环境中我们在常氧和缺氧条件下培养转染的骨髓间充质干细胞，研究了Hif1a对骨髓间充质干细胞的影响（图5A）。低氧条件下Hif1a过表达的转染效果更好，因为Hif1a在低氧环境下更容易被激活和稳定（图5B-C）。细胞实验表明，缺氧条件下，细胞活性减弱，Hif1a过表达促进细胞在缺氧环境下生长（图5D-E）。此外，在常氧和低氧条件下，过表达Hif1a均能提高ATP水平，在低氧条件下，ATP水平的升高更为显著，这与Hif1a蛋白表达一致（图5F），Hif1a过表达组乳酸含量显著增加（图5G）。化学需氧量（OCR）在缺氧条件下下降，但在Hif1a过表达后略有恢复（图5H）。
图5 Hif1a在缺氧条件下增强骨髓间充质干细胞的活性
为观察缺氧条件下Hif1a过表达对骨髓间充质干细胞分化的影响，采用不同诱导培养基培养P4和P6骨髓间充质干细胞。在成骨诱导条件下，骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞的数量减少，Hif1a过表达，成骨相关基因ALP、Runx2、BMP2的表达显著降低（图6A-C）。在脂肪诱导条件下，Hif1a过表达导致骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化的数量减少，导致脂肪生成相关基因LPL、aP2和PPAR-γ的表达显著降低（图6D-F），提示Hif1a过表达阻碍了骨髓间充质干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化。在成软骨诱导条件下，过表达Hif1a的骨髓间充质干细胞分化成软骨细胞的数量显著增加，并伴有成软骨相关基因SOX9、Col2a1和Agg的显著上调（图6G-I），表明骨髓间充质干细胞在缺氧条件下更容易发生成软骨分化。
图6 缺氧条件下骨髓间充质干细胞分化的诱导
6. Hif1a在骨髓间充质干细胞中的过表达增强软骨细胞胶原稳定性
然后，研究者将分离的软骨细胞与过表达Hif1a的骨髓间充质干细胞共培养，相对于成骨基因和脂肪基因，软骨相关基因的表达显著增加（图7A），同时Hif1a过表达增强了软骨细胞的细胞活性（图7B-C）。此外，Hif1a增强了软骨细胞胶原蛋白的稳定性，保证了软骨骨化的进展（图7D-J）。
图7 Hif1a对共培养系统的影响
7. Hif1a过表达促进软骨T转化和骨折愈合
Hif1a可以促进骨折愈合，这是一个涉及多个骨骼发育事件的再生过程，包括软骨内和膜内骨化。研究者对骨髓间充质干细胞进行oe-hif1a处理，制备oe-hif1a处理过的GBMA@BMSCs水凝胶，将其植入骨折大鼠骨髓腔进行治疗，观察oe-hif1a对大鼠骨折修复的影响（图8）。X射线、组织学评价、免疫荧光染色、骨体积/组织体积和小梁数量等结果显示，oe- hif1a组软骨组织生成更多，软骨转化开始时间更早，软骨修复作用更为明显；也可以促进愈合中后期血管重建，从而促进新骨形成。
图8 oe-hif1a处理GBMA@BMSCs水凝胶对大鼠骨折愈合的影响
综上，本文利用先进的生物3D打印技术，结合骨髓间充质干细胞和仿生水凝胶构建方法，建立了一种治疗骨折的创新方法。与传统的骨折治疗方法相比，该技术在定制化、高生物相容性和3D结构复杂性方面具有优势。
文章来源：
https://doi.org/10.1002/adhm.202402415
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