《AFM》3D 打印 “肠” 奇迹：构建三培养管状网状人工肠

来源：EFL生物3D打印与生物制造

先天性肠道闭锁或狭窄等疾病常需手术干预，但对于胎儿或儿科患者，手术切除可能引发短肠综合征，进而需要器官移植。然而，胎儿供体短缺限制了器官的可获取性，因此开发类器官再生疗法和人工器官迫在眉睫。在人工肠道的研究中，尽管3D生物打印技术取得了一定进展，但此前的研究多聚焦于肠道内壁部分结构的构建或药物吸收模型的开发，无法充分模拟天然肠道的完整结构和功能。已有的方法在容纳细胞类型、机械性能以及促进细胞间相互作用等方面存在不足，难以满足实际移植需求。  

来自韩国机械与材料研究所、忠南国立大学和韩国生物科学与生物技术研究所的Seok-jo Yang教授和Junhee Lee教授团队合作开展研究。他们利用混合3D打印技术，构建了一种三培养管状网状肠道（TTMI），整合了肌成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。该团队通过使用低浓度的明胶甲基丙烯酰（GelMA）生物墨水提高细胞活力，采用双冷却模块改善打印性能，并运用多头四轴生物打印机增强支架的机械性能。相关工作以“Hybrid 3D-Printed Tri-Cultured Intestine with Tubular Mesh Structure”为题发表在《Advanced Functional Materials》上，为人工肠道的发展提供了新的方向，有望推动组织工程和再生医学领域的进步。

研究内容
1. 用于TTMI的多头3D打印系统开发，通过构建先天性肠道闭锁或狭窄胎儿的人工肠移植模型，利用多头四轴可控3D生物打印机及加热、冷却模块进行实验，研究了TTMI的设计、构建过程以及细胞在其中的分布和相互作用。结果表明，成功设计并制备出具有四层结构、包含三种细胞类型的TTMI，其结构稳定性良好，细胞间能有效相互作用，模拟了天然肠道的部分结构和功能。

图1. 用于TTMI的多头3D打印系统开发。  

2. PCL管状网的机械性能，使用万能测试机和特定夹具对不同网格间距的PCL管状网进行拉伸测试，测量其应力 - 应变曲线、弹性恢复率等指标。研究了PCL管状网的拉伸强度、屈服强度、弹性模量以及弹性恢复率与网格间距的关系。结果显示，随着网格间距从0.6mm增加到2.0mm，拉伸强度、屈服强度和杨氏模量降低；网格间距为1.0mm和1.2mm时各项性能表现相似；弹性恢复率在网格间距为1.0mm时较好，综合考虑选择1.0mm网格间距制备管状网。

图2. PCL管状网的机械性能。  

3. 使用双冷却模块打印低浓度GelMA，运用旋转流变仪测量GelMA的流变特性，通过COMSOL模拟和实际测量温度，研究了不同浓度GelMA在不同温度下的溶胶 - 凝胶转变行为，以及双冷却模块对低浓度GelMA打印的影响。结果表明，不同浓度GelMA的溶胶 - 凝胶转变温度不同，双冷却模块能有效维持2%和3% GelMA的凝胶状态，确保管状生物打印的形状保真度，并得出了不同浓度GelMA打印的最佳温度和时间条件。

图3. 使用双冷却模块打印低浓度GelMA。  

4. 优化GelMA浓度以提高打印性和细胞活力，将HUVECs和CCD - 18Co细胞分别封装在不同浓度GelMA中进行打印，利用荧光显微镜观察细胞活性和形态，通过CCK - 8实验检测细胞增殖情况。研究了不同浓度GelMA对两种细胞的活力、增殖和分化的影响。结果显示，2% GelMA有利于HUVECs的增殖和维持形态，3% GelMA对CCD - 18Co细胞的增殖和分化最为有利，因此分别选择2%和3% GelMA用于封装这两种细胞。

图4. 优化GelMA浓度以提高HUVECs和CCD - 18Co细胞的打印性和活力。  

5. CCD - 18Co和Caco - 2细胞在TTMI中的相互作用，将Caco - 2细胞和CCD - 18Co细胞分别接种或共接种在3% GelMA打印的PCL管状网上，运用荧光显微镜观察细胞存活和生长情况，通过CCK - 8实验检测细胞增殖，用碱性磷酸酶（ALP）和DNA检测评估细胞分化，借助扫描电子显微镜（SEM）观察微绒毛。研究了两种细胞在TTMI中的相互作用对细胞增殖和分化的影响。结果表明，两种细胞共培养促进了Caco - 2细胞的增殖和分化，PCL管状网有助于细胞间相互作用。

图5. CCD - 18Co和Caco - 2细胞的相互作用促进肠上皮生长。  

6. TTMI的生物学特性，对含有三种细胞的TTMI进行细胞追踪、组织学染色、免疫染色和跨内皮电阻（TEER）测量等实验，研究了TTMI中细胞的增殖、分化、定位以及上皮膜形成情况。结果表明，TTMI中三种细胞类型的排列与天然肠道相似，细胞增殖和分化良好，细胞间相互作用促进了上皮膜的形成，证明TTMI可作为体外模型模拟肠道的部分功能。

图6. TTMI的生物学特性。

研究结论
本研究构建了一种模仿人类胎儿肠道结构和细胞组成的三培养管状网状肠道（TTMI），这是人工肠道发展的重要进展。研究将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、人正常结肠成纤维细胞（CCD - 18Co）和人结直肠腺癌细胞（Caco - 2）整合到人工肠道中，发现其可支持细胞增殖、分化并形成功能性肠屏障，证实了三培养技术在组织工程中开发可植入材料的适用性。通过结合多头3D生物打印机与混合打印技术、旋转接种板、四轴控制系统以及加热和双冷却模块，成功制备出TTMI。该模型细胞增殖和分化率高，细胞间相互作用促进了上皮细胞分化和上皮膜形成。不过，TTMI模型仍需体内验证。此外，4D形状记忆技术的发展可能有助于提升其植入后的机械强度和弹性恢复能力。TTMI为研究肠道生理、药物吸收和疾病建模提供了有用平台，在再生医学和个性化移植治疗方面具有潜在应用价值。

文章来源：
https://doi.org/10.1002/adfm.202424495