电纺+近场直写打印小直径血管支架

来源：EngineeringForLife

血管移植，特别是小直径血管(<6mm)的替换仍然是临床医学的一大主要挑战。因为植入物会产生比如堵塞、内膜增生或血栓相关问题。为促进组织再生，血管支架还应该引导细胞分化以获得天然血管的功能。为此，支架必须引导管腔内部内皮细胞单层的形成以模拟血管内膜。此外，还应实现血管平滑肌细胞(vSMCs)的堆积和定向来模拟膜介质的外层。到目前为止，如何设计与制造符合要求的支架来促进仍然是一个挑战。为此乌得勒支大学的Debby Gawlitta和维尔茨堡大学的Jürgen Groll在Advanced Functional Materials上发表了“Heterotypic Scaffold Design Orchestrates Primary Cell Organization and Phenotypes in Cocultured Small Diameter Vascular Grafts”，文章介绍了一种由溶液电纺丝与熔融近场电直写相结合的混合制造方法，制备了一种能模拟组织结构的双层复合管状支架，其中包括内层随机定向的致密纤维网和外层定向可控的纤维。该支架能够诱导细胞形成连续的管腔单层内皮细胞和定向的平滑肌细胞层，从而促进组织细胞特异性分化。并且该方法不需要额外的可溶性因子或支架表面的生物活化材料，说明异型支架的结构设计可以诱导细胞的生长和分化。

血管支架有5个要求：

• 支架应提供一种基底，使内皮集落形成细胞（ECFCs）在其上形成单层。
• 支架上形成的内皮细胞单层应表达成熟的EC标志物、基底膜成分和ECM，以及与vSMCs沟通相关的信号。
• 支架应该具有一个多孔的外层，vSMCs可以在其中迁移和填充，以实现多层细胞组织的伸长。
• vSMCs应以近圆周方向排列，具体由可由支架纤维的方向控制。
• 支架应该为间充质干细胞（MSCs）分化为vSMCs收缩表型提供环境
  

因此，研究人员提出一种混合工艺的复合血管支架制造工艺，如图 1。首先由溶液电纺PCL纤维形成管状支架内层(孔隙率为80%±5%，内径3mm)，纤维直径为1.4±0.2μm，纤维去向随机分布。其次，用同样的材料采用熔融近场电直写的工艺制作外层，纤维直径15.2±4.8μm，纤维缠绕角度在30°到70°之间，具有可控制的大孔径。

图1 双层管状支架的制造。A）溶液静电纺丝制造管状支架内层。B）熔融电直写将定向纤维沉积在管状支架外层。C）双层支架最终结构。双层支架由同种材料组成，不同尺寸的纤维融合在一起，防止分层。

支架的体外实验结果如图 2，成功将尚未内皮化的ECFCs与MSCs共培养，并且ECFCs未渗透过孔径非常小的溶液纺丝层。扫描电镜(SEM)显示相邻的ECs(黑色箭头)与纤维(白色箭头)之间建立了连接，表明内皮细胞受到限制，通透性较低。在体内，具有屏障功能的内皮细胞是抵抗血栓形成的关键。这样就产生了具有抗凝血特性的内层，类似于天然内皮的特性。

同样，单层膜显示血小板黏附糖蛋白因子(vwF)内皮标记物染色阳性(图2D)，并由iv型胶原阳性基质(图2E)支撑，这也天然基底膜中发现，说明了支架仿生性能。一氧化氮被认为是主要的血管扩张剂之一，参与抑制血小板聚集，是功能化内皮细胞所必需的。在实验中中测量到的NO表明，当在仿生双层支架上培养时，所形成的内皮细胞具有功能并具有向类vsm细胞发出信号的能力。

此外，大孔隙和较粗的近场电直写纤维可以诱导类vsm细胞快速渗透，从而满足MSC/ECFC共培养(图2J)和MSC单培养。接种的MSCs覆盖整个支架的外表面(图2G)，并呈直线排列(图2H)。IV型胶原也被合成(图2I)，它将单个的vSMCs包裹成基底膜样基质。

图2 双层异质血管支架上的细胞培养结果。A）的同时培养ECFCs (CD31 +)和vSM-like细胞(αSMA +)后17 天的分层组织 (横断面视图)；B）溶液纺丝层上细胞的内皮化；C）紧密的细胞连接(黑色箭头)和细胞挤压(白色箭头)；D）和E）内皮细胞的特异性表达；F）内皮细胞产生一氧化氮(NO)向vSM-like细胞传递信号；G） vSM-like细胞的定向排列；H）沿着纤维伸长的αSMA +细胞；I）IV型胶原在细胞排列方向的沉积；J）在7天后vSM-like细胞充满了管壁，并呈圆周方向排列。除有特殊标注外，比例尺为100μm。

对于近场电直写的支架外层结构，随着支架纤维缠绕角的增加，细胞的方向改变为近周向(图3A)，与原膜介质相同。通过控制纤维的取向，可以模拟组织的方式引导管状支架上的vSMCs的取向。外层的多孔结构促进了细胞的快速生长，并产生了几层定向排列的细胞，细胞间具有密切相互作用。

图3 熔融纤维取向对间充质干细胞的影响。A)代表性支架植入前扫描电镜图像(上)和植入后培养7 天后 F-actin染色细胞 (下)。B)整个管壁厚度上的细胞以及熔融电直写粗纤维的平均取向。

为了更深入地调查在大孔径支架上增加的细胞相互间作用对MSCs分化的影响。研究人员比较具备与不具备外侧熔融电直写纤维的细胞结果。结果表明在孔板中与单层溶液纺丝支架上培养的MSCs具有相似的相对基因表达水平。而在双层血管结构培养的MSCs与单溶液纺丝层培养的MSCs基因表达水平具有较大区别。DNA与蛋白表达的实验结果也是类似。

图4 融合驱动的MSCs向vSMCs分化结果。A）培养7 d和14 d后在孔板中与单层溶液纺丝支架上培养的MSCs相似的相对基因表达水平；B）培养7 d和14 d后，双层血管结构培养的MSCs与单SES层培养的MSCs基因表达水平的比较；C-D）qPCR对比结果；E-H）细胞在单纯溶液纺丝支架与双层异质支架上的蛋白表达区别。

这种复合结构的异质支架具有类似于原生血管内外膜结构，内侧溶液纺丝层具有小直径与低细胞通透性，能促进内皮细胞层的形成；而低纤维密度、可控沉积定向的多孔外膜是实现类vsm细胞定向快速定植的基础。不需要可溶性因子和表面功能化，紧靠放生的结构设计，引导指导细胞的形态和分化。未来还可以探索是否可以利用这种异型设计来调节免疫反应，使之朝着再生的方向发展。

论文链接：https://doi.org/10.1002/adfm.201905987