手术中生物打印：手术环境下的组织与器官修复

来源：EngineeringForLife  

术中直接3D生物打印技术（下文简称“术中打印”）可以通过快速获取受损部位的信息，在活体上进行生物打印修复受损组织器官，是一种高效的生物打印策略。对于需要进行组织切除、创伤重建或骨折修复的患者，术中进行受损部位的扫描和生物打印对于提高修复的准确性和效率具有很大的潜力。近期，哈尔滨工业大学（深圳）的吴洋教授连同美国宾夕法尼亚州立大学的Ibrahim T. Ozbolat教授与DinoJ. Ravnic教授在Trends in Biotechnology杂志上发表了题为“Intraoperative Bioprinting: Repairing Tissues and Organs in a Surgical Setting”的观点性综述文章，从工程和临床的角度为读者介绍当前术中打印的主要局限，以及未来其从实验室到临床转化的潜力，并着重展开介绍血管化组织和复合组织的术中打印。

一、从体外生物打印到术中打印
在过去的十年中，生物打印技术取得了长足的进步，并在不同组织工程领域得到应用，如组织再生、血管形成、药物筛选和疾病建模等。然而，大多数生物打印工作是在体外进行，需要在体内进一步验证。虽然器官直接打印入人体仍十分困难，但科研人员已做出了一些尝试。 术中打印，也称为原位打印或体内生物打印，是指在手术中对活体进行生物打印的技术，包括缺损部位成像、数据处理、工艺路径规划和生物打印等在整个手术过程中的有序进行。组织替代物的术中打印得益于其可以在解剖学上准确地重现复杂组织的异质性。尽管术中打印尚未临床化，但在生物打印技术的快速发展以及不同领域研究人员的共同努力下，该领域正在稳步地发展。

术中打印有诸多优势。首先，基于水凝胶或细胞聚集体的组织替代物由于其富水特性，初始机械性能通常较弱，使得其在手术操作过程中容易被破坏甚至解体。相反，借助逆向工程方法实现植入体的实时设计，术中打印可以最大限度地降低缺损修复中的污染、结构体崩解和手动干预带来的风险。更重要的是，术中打印可以应对临床上由于清创或组织切除而产生的具有不规则平面的组织缺损。相比之下，体外生物打印通常假设工作表面平整，与临床情况不符。此外，由于术中打印修复的结构被天然组织包裹，内源性细胞通过生物化学与物理方式的诱导，可以迁移到打印的结构中，并分化成具有靶组织特异性的谱系。另外，与手动注射生物材料进入缺损部位相比，术中打印可以精确地沉积细胞、基因或细胞因子，实现局部结构的精确控制与解剖学仿生。对于异质细胞形成的组织及区域分层排列的细胞外基质，术中打印具备精确重构多层结构的能力，这是使用手动方式难以实现的。最后，水凝胶的形状变形（例如皮肤再生过程中胶原蛋白的收缩）也是生物打印结构在体外成熟过程中面临的问题。此外，细胞在体外培养过程中会重塑基质，并最终改变甚至破坏预先设计的形态。因此，术中打印的优势也体现在体内整合过程中再生组织可能占据由于打印结构收缩产生的空隙，并调节基质的重塑。

二、术中打印的最新进展
尽管术中打印的概念在2007年就首次被提出，但由于在活体上进行生物打印难以实现，后续较少有相关的研究报道。相对于植入预先制备的结构体，术中打印对生物墨水的制备、生物打印设备、灭菌和手术操作提出了更高的要求。到目前为止，研究人员已运用术中打印针对软骨、骨骼和皮肤的修复进行了一些尝试。例如，手持式生物墨水挤出设备已被分别用于羊的软骨修复模型（图1A）和猪与鼠的皮肤修复模型。尽管材料沉积过程是手动进行的，但手持设备提出了一套完善的策略以减少水凝胶交联所需的外部设备。在骨骼修复方面，Keriquel课题组使用自主开发的激光生物打印系统在小鼠颅骨缺损模型中进行术中打印（图1B）。在他们的后续研究中，术中打印产生了组织化的微血管网络和颅骨缺损的骨再生。目前，由于皮肤的易接触性与强大的再生能力，术中打印最成功的案例大多与皮肤修复相关。近来，Albanna课题组开发了一款集成了生物成像技术的移动式皮肤生物打印系统，并对小鼠和猪的全层皮肤伤口模型进行了修复（图1C）。下文将重点介绍目前术中打印在工程和临床方面的主要局限，并突出阐述其在血管化组织和复合组织重建中的临床转化潜力。

图1 各种术中打印技术在不同组织修复中的应用

三、术中打印的关注点与未来展望
1. 当前生物打印方式的局限性
生物打印按技术主要可分为挤出式、液滴式与激光式。将现有的技术直接应用于术中打印会面临诸多挑战。挤出式的生物打印可被认为最适用于术中打印。手动注射（挤出）生物材料已在临床上应用了数十年，挤出式打印头可以被方便地配置在当前应用于泌尿外科和妇科的手术机器人上，实现术中打印。然而，由于挤出式打印头多为接触式，打印头可能会干扰缺损部位周边的正常组织。对于液滴式打印技术，尽管其分辨率优于挤出式，但生物墨水在针头小孔处的沉淀会提高喷嘴堵塞的风险，增加手术时间并引发其他并发症。受限于打印结构较弱的机械性能，液滴式技术更适合打印厚度较薄的组织，例如皮肤。激光式打印技术具有与液滴式相似的优势（如：高分辨率）和劣势 （如：打印结构的机械强度低）。由于其组成部件的复杂性（如：激光源和光学组件），激光式打印设备的小型化也是一项挑战， 复杂的组件限制了体内深层组织打印的可能性。

2. 生物墨水与手术环境的兼容性
由于术中打印的材料沉积是直接在生理条件下进行的，因此，理想的生物墨水不仅应满足一般生物墨水要求，而且还应具备一些特定属性，包括1）与所用打印技术兼容并可进行术中打印，以缩短手术时间，2）可快速地在生理温度与湿度条件下进行原位交联，以保留打印结构的完整性和分辨率，3）可商业化与平价化，以降低手术成本。因此，大多数常用的需要挥发性有机溶剂溶解或高温熔融的生物材料（如：聚己内酯，聚乳酸等）不适用于术中打印。在水凝胶中，尽管胶原蛋白在37°C可转变为凝胶状态，但其缓慢的凝胶化阻碍了其在术中打印中的使用；然而，纳米羟基磷灰石增强的胶原蛋白在骨组织的术中打印中表现出了优异的性能。由于纤维蛋白原可与凝血酶轮流打印实现快速交联，其在术中打印中也很受欢迎。光交联生物油墨，例如明胶甲基丙烯酰胺（GelMA）、透明质酸甲基丙烯酸酯（HAMA）和聚乙二醇也常用于生物打印。由于将生命体直接暴露在紫外线中可能损伤组织，一种可行方案是将紫外线射向透明打印头的侧面，在生物墨水挤出过程中实现交联固化。近来，由于可见光光引发系统能避免使用紫外线交联破坏细胞活性，其应用也开始普及。除现有的生物墨水外，更多适用于术中打印的材料应被开发来为术中打印提供更多选择。新材料应能在无支撑结构的情况下保留生物打印结构的完整性。

3. 术中打印过程的自动化
由于伤口的长时间暴露会增加手术并发症的风险，因此，缺损部位的成像应在组织切除后的数分钟内完成。为了满足此要求，基于3D摄影测量的扫描技术为获取缺损部位的形貌数据技术提供了最优解决方案。此类扫描仪能够达到高达30 μm的分辨率，扫描时间短，且具有便携性等优势。此外，图像处理在创建组织模型时也必不可少，包括图像预处理、分割、特征提取和数据挖掘等。术中打印式，上述所有过程应在获取扫描数据后的几分钟内完成。因此，优秀的图像分割软件对于方便地提取感兴趣区域的3D图像信息至关重要。由于不同的缺损组织具有其独特的纹理特征，不当的图象后处理可能会生成无意义的3D模型，因此，需要对模型进行仔细评估。人工智能和机器人技术可以协助减少图象处理时间和操作员造成的误差。迄今，研究人员一直致力于优化术中打印的路径规划，例如使用运动跟踪在自由移动的手部解剖结构上进行打印。将来，机器学习也可用于自动产生最佳的生物打印策略。

由于水凝胶的溶胶-凝胶转化和手术中活体运动（如：呼吸）引起的形状变形， 实现术中打印的自动化、保证打印精度具有很大的挑战性。此难题有望通过实时监控技术观察打印结构的形变，为后续材料沉积提供反馈信号来解决。当前已商品化的三轴生物打印设备不足以应对具有不规则形状的缺损组织的术中打印，需要使用具有更高自由度的平台，多自由度的机械臂（如：手术机器人）可能是理想的解决方案（图2A）。

4. 术中打印组织的血管化
血管化对于生物打印结构的成熟至关重要，尤其是节段性缺损。驱使术中打印组织的微血管化有多种方式，例如生物打印内皮祖细胞、缺氧诱导因子或血管内皮生长因子等。由于新血管生成通常需要10天以上才能开始发生，一些暂时性策略可以用来延长氧气供应。 例如，在生物墨水中参入富氧微粒或制氧生物材料，此类生物墨水旨在为细胞提供营养直到毛细血管可以传输血液。多孔内部结构的引入是生物打印的优势，同时也为促进血液从宿主组织渗透到打印结构体提供了另一种选择。

术中打印的最终目标是创建一个连接动脉和静脉、包含嵌入式微脉管系统的结构体。随着超显微外科技术的发展，现在直接吻合内径小于150μm的微血管已经变得可行。该技术进步使得植入体无需暴露于主血管树便可快速实现血液流动。为了促进植入体的吻合和血管形成，手术中也可以利用各种自体导管创建动静脉循环。

图2 术中打印修复血管化复合组织的示意图

5. 复合组织的术中打印及其临床转化
当前，具有多个组成部分的组织的无缝重建仍存在局限，例如：颅颌面缺损（皮肤，骨骼和肌肉），骨软骨缺损（软骨和骨骼）以及肌肉骨骼缺损（骨骼，肌肉，肌腱和皮肤）。不同组织类型在生理学、解剖学和组织学方面存在差异，因此，不同组织层的精确打印至关重要。由于将不同部位的干细胞分化为多个谱系能够模仿天然组织的解剖结构，术中打印需要精确而高效地沉积干细胞和分化因子。以肌骨骼为例，它由内而外包括骨骼、血管、肌肉、皮下脂肪和皮肤组织，包含10种以上细胞类型 （图2B）。

复合组织的术中打印应以最少的手动干预快速获取缺损部位信息 ，保证解剖学上的准确性。虽然结构体打印时通常按照天然组织的层次结构进行设计，然而，打印组织在成熟过程中可能会改变其结构和表型，从而与天然组织产生差异。由于复合组织通常厚度较大，因此血管形成对于促进组织再生特别重要；血管化不足将导致坏死的疤痕组织占据缺损部位。目前，皮瓣外科手术是修复复合节段性缺损的标准。皮瓣是一种自体组织移植物，其中供体组织连同其血管蒂（动脉和静脉）被整体转移到受体部位。这种技术彻底改变了大型创伤和肿瘤缺陷的治疗方法。但是，皮瓣有限的供体数量和供体部位发病率限制了其应用。因此，最好的方案是将该手术原理和术中打印技术相结合。外科医生可以通过直接血管吻合或诱导血管生成的方式将受体血液灌注至邻近的打印结构体中。两者的结合将会消除关于供体数量和发病率的担忧，同时提供精确匹配的替换组织。未来，生物打印的组织工程化植入物或可代替自体皮瓣。

术中打印的另一个关注点是天然组织与打印组织，特别是无血管组织的融合（如：软骨修复）。由于骨骼先天具有较强的修复能力，软骨在垂直方向上可以与下层骨整合。术中打印具有骨软骨界面的复合组织也是提高软骨愈合能力的一个有效的解决方案，可以被应用到全厚度骨软骨的缺损修复中。然而，打印软骨与天然软骨的横向连接将是实现永久性软骨置换的主要障碍。增强软骨横向整合的策略包括生物墨水的功能化，使之能直接粘合到到相邻的天然软骨上。
此外，目前术中打印用到的动物模型很少是承重型组织，例如皮肤和颅骨缺损。未来，将术中打印用于修复承重型缺损模型，如长骨的节段性缺损和关节缺损，将获得更多关注。术中打印结构体的机械强度取决于生物墨水的固有特性，可以通过开发新材料来提高结构体的机械强度。在这方面，可设想将柔性生物墨水与热塑性生物材料（如：聚己内酯或聚乳酸-乙醇酸共聚物）相结合，开发一种便于热塑性材料快速、安全冷却的打印技术（如：基于激光的冷却系统）。另外，常规的术后护理和康复仍然必不可少，直到打印的组织获得足够的机械强度。

四、结语
术中打印已在组织再生的应用中，包括软骨，皮肤和骨骼等，显示了其潜力。然而，复合组织包含软、硬组织以及之间的界面组织，其再生修复有赖于具有快速稳定的交联性能的生物墨水以及先进生物打印技术的开发。此外，寻求一种切实可行的方法来促进血管生成对于组织长期的功能化至关重要。将生物打印与血管吻合术相结合，代替目前流行的皮瓣手术，显得十分具有吸引力。从长远来看，术中打印的自动化不仅是打印流程的简单集成，同时也需要大量临床案例来优化生物打印的策略。除了科学方面的考量，术中打印的临床研究也将面临伦理与监管的考验，共享病人信息用于数据库的建立将引发私人信息与知识产权保护方面的挑战。尽管面临诸多问题，作者仍坚信术中打印将在组织器官修复再生领域产生巨大作用。

论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2020.01.004