北京协和医院等机构3D打印肝脏！延长肝衰竭小鼠模型的存活时间

来源：BioArt生物艺术

脏移植是治疗各种终末期肝病的唯一方法。然而供体肝脏的短缺一直是临床上限制肝移植的最主要因素。近年来，3D生物打印技术在医学领域的发展非常迅速，比如神经外科，颌面外科等。该技术在肝脏移植领域也频有捷报传来。最早在2013年，科学家首次报道了利用3D打印技术将3例捐献者及患者的肝脏制成3D模型，用以指导接下来的移植策略。同年，有公司成功打印出深500 μm的肝脏组织，能正常存活40天，并且在体外具有普通肝脏的功能，后续该公司也打印出了具有生物活性的完整的迷你肝脏。但3D打印的肝脏组织能否在体内发挥功能尚不清楚。2015年，北京协和医院毛一雷教授成功在该领域取得突破并在当年举行的十五届全国肝癌学术会议作了报告，其研究团队成功在3D打印细胞结构中实现了胆管网广泛分布，提高了三维结构的物质交换能力，最终得到了体外能长期存活的具有药物代谢功能的人体类肝组织。

近日，来自北京协和医院的毛一雷教授、清华大学孙伟教授以及上海科技大学黄鹏羽教授的研究团队在GUT杂志在线发表了题为Three-dimensional bioprinted hepatorganoids prolong survival of mice with liver failure的文章，该研究以肝细胞和生物墨水为原料，采用特定的3D打印程序，打印出了肝脏类器官（3D bioprinted hepatorganoid，3DP-HO）。该3D打印类肝器官不仅在体外具有良好的肝脏特征，将其移植到I型酪氨酸血症肝衰竭模型小鼠体内，也能显著改善小鼠的肝功能，并提高小鼠的存活率。这不仅为开发针对肝脏疾病的新型疗法提供了新的工具，更展示了3D生物打印类器官的体内活性和该技术在肝脏移植领域的应用潜能。

作者首先探索了用于打印肝脏类器官的原料以及诱导分化的条件。作者在前期实验中对比了原代肝细胞、胎肝细胞以及多种肝细胞系。但原代肝细胞在3D打印过程中死亡率过高，而胎肝细胞和HepG2细胞（一种肝癌细胞系）的肝脏功能较差。综合考虑对3D打印的耐受性和肝功能之后，作者采用了HepaRG细胞（一种人肝祖细胞）进行后续的3D生物打印。生物墨水（用于粘合细胞的生物材料）的选择在3D生物打印过程中也非常关键。明胶和藻酸盐在用氯化钙处理后具有良好的生物属性，可以用作生物墨水。研究人员系统测试了不同比例的明胶和藻酸盐，最终选择了5％明胶和1％海藻酸盐用作生物墨水组合。此外，温度也是影响3D生物打印成功率的关键因素。研究人员经对比测试后，采用在喷嘴中保持20℃，在成形空间中保持10℃来打印3DP-HO。

为了促进3DP-HO中HepaRG细胞向肝细胞分化和成熟，作者先将3DP-HO在体外培养3天，然后通过0.5％DMSO处理7天诱导肝向分化。结果表明3DP-HO中HepaRG细胞可以在体外分化为白蛋白阳性的肝细胞(82.5%±4.6%)。经体外诱导肝向分化后的3DP-HO也表达了大量的肝脏特异性基因，并具有了积累肝糖原、转运吲哚绿和乙酰化的低密度脂蛋白的能力。非常重要的是，3DP-HO也具有良好的肝脏解毒功能。与2D培养的HepaRG细胞，以及传统的3D培养的HepaRG细胞相比，3DP-HO无论在肝脏基因表达还是功能上都更具优势。这些结果表明3DP-HOs在体外诱导肝向分化后表达了肝脏基因，并获得了一些关键的肝脏功能。

研究人员随后将体外诱导肝向分化的3DP-HO移植到了免疫缺陷的I型酪氨酸血症肝衰竭模型小鼠体内，这也是这项研究的一个重要的亮点。在接受3DP-HO移植后第4周，小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、总胆红素、直接胆红素、谷氨酰转肽酶和碱性磷酸酶水平显著降低，说明3DP-HO移植缓解了肝脏损伤。移植小鼠血清中酪氨酸等相关氨基酸水平也显著下降，说明3DP-HO对I型酪氨酸血症小鼠的酪氨酸代谢缺陷有明显的治疗效果。

在移植小鼠的血清中，研究人员也检测到了大量人员的白蛋白、抗胰蛋白酶、凝血因子VII和凝血因子IX。尤其是，研究人员发现移植3DP-HO的小鼠获得了人肝细胞特异的代谢异哇胍（debrisoquine）的能力。这说明3DP-HO确实在移植小鼠体内发挥了肝脏的功能。此外，移植3DP-HOs也改善了小鼠原生肝脏的坏死现象。最重要的是，移植3DP-HO的肝衰竭小鼠存活时间显著延长，并且移植后的3DP-HO中形成了新的血管网络。

总而言之，研究人员使用了HepaRG肝祖细胞通过3D生物打印技术来构建肝脏类器官。该类器官在体外和体内均表现出良好的肝脏功能，并且在移植后能够延长肝衰竭小鼠的生存期。尽管这项研究距离临床应用还很远，但是这一开创性研究展示了3D生物打印技术在肝移植治疗中的潜在价值。相信不远的将来，科学家可以利用生物3D打印技术打印出可供移植的人类肝脏，而这将造福万千肝病患者。