Biomaterials：投影式光固化3D打印仿生皮肤

来源： EngineeringForLife

由于日益增长的老龄化人口不断推动需求的增长，在当今临床实践中，容易移植的供体组织和器官的短缺仍然是一个重大问题。组织工程(通常由支架、细胞和生长因子组成)已成为修复受损组织的一种有前途的替代方法。对于现有的生物打印技术来说，制作适合植入的器官仍然是一个挑战，主要原因是无法再现器官复杂的解剖结构、机械性能和生物功能。此外，无法制造具有营养输送功能的微通道结构，也限制了3D打印技术的临床应用。

作为人体最大、增长最快的器官，皮肤在保护身体免受外部损伤方面起着至关重要的作用。由于自我修复能力有限，三度烧伤和真皮全层缺损等创伤性伤口是最难愈合的伤口;因此，需要供体皮肤或生物工程人类皮肤构建体(HSCs)来辅助再生过程。然而，由于供体皮肤的缺乏、长期生存能力差以及缺少造血干细胞的附属物来，皮肤再生仍然是一个严峻的挑战。为此浙江大学的章淑芳副教授和欧阳宏伟教授课题组利用光固化3D打印技术，使用新设计的GelMA/ HA-NB/LAP生物墨水，打印了具有仿生结构的仿生皮肤。仿生皮肤中相互贯通的孔道可以促进营养物进入和氧气的交换，有利于细胞黏附，迁移和增殖与新生组织形成，相应研究成果发表于期刊Biomaterials上。

研究人员采用GelMA/HA-NB/LAP作为材料，一方面原因在于其快速凝胶化特性，并且与天然ECM的结构相似，这可以为细胞的生长和组织再生提供有益的微环境。同时，在紫外光的作用下，凝胶链上的醛基与胺基发生反应，HA-NB可以很容易地调节凝胶的力学性能，如Figure1。此外，GelMA/HA-NB/LAP水凝胶还可作为一种粘合剂，在体内植入时起到固定作用。在打印方法上，相较其他生物3D打印方法，基于投影式光固化的3D打印技术具有更高的打印速度、微尺度分辨率和更高的细胞存活率，在打印复杂器官结构方面取得了突破。

图1 快速光固化生物墨水与投影式光固化打印

皮肤通常分为两层：致密的上层(表皮)和疏松的下层(真皮层)。为此研究人员设计了相应的仿生结构，上层(500μm)致密，有利于保护伤口免受外部机械冲击和压力。底层(1.5 mm)为悬臂梁多孔结构结构，可促进细胞迁移和氧/营养交换，从而促进血管生成，如Figure2。为确定最佳的孔径尺寸，研究人员设计并打印了不同的微通道尺寸(200μm、300μm、400μm)。在经过力学测试后，最终选择了微通道尺寸为200μm的支架进行进一步的研究以修复皮肤缺损，而无微通道的支架作为对照。

图2 3D打印复杂的双层凝胶仿生皮肤结构

为了评估基于投影式光固化的3D打印功能性皮肤的生物相容性，将HSFs和HUVECs分别混合入生物墨水并打印成无微通道和有微通道的支架。这些结果表明细胞存活率高(>95%)，支持细胞生长和增殖，水凝胶生物墨水具有良好的生物相容性，在构建三维组织方面具有广阔的前景，如Figure3（A-F）。然后，研究人员使用TIANamp基因组DNA试剂盒检测结构中不同层中HSFs和HUVECs的总DNA。第5天HUVECs的DNA含量几乎比第1天高出2倍，HSFs在第5天的DNA含量比第1天高出近3倍，说明生物墨水支持HUVECs和HSFs的生长和增殖。功能化的活体器官需要维持其固有的结构，以支持细胞的生长和增殖。在第5天的荧光通道下观察到较低层的结构被很好地区分出来，这表明整个结构没有失去其原有的设计，如Figure3G。

图3 仿生皮肤的细胞相容性、细胞增殖和结构可持续性

为观察仿生皮肤内的细胞迁移，研究人员将标记的HSFs与HUVECs混于生物墨水中，并进行分区域打印，如Figure4。标记的细胞从最初的界限分明到5天后的互相渗透，结果证明相互连通的微通道结构可以促进氧/营养灌注和诱导组织形成，从而促进细胞吸附和迁移。

图4 仿生皮肤内的内细胞迁移分析

此外，支架还必须支持宿主细胞的粘附、迁移和增殖，以刺激新组织的形成。为了评估这一特性，将HSFs和HUVECs作为宿主细胞接种在支架表面(无微通道)和仿生皮肤（含微通道）上，如Figure5。结果表明，该生物墨水具有良好的生物相容性，能够促进细胞的增殖和迁移，有可能在体内吸引其他宿主细胞，促进新组织的形成。

图5 仿生皮肤外细胞迁移和粘附分析

研究人员使用大鼠和猪进行了全层皮肤缺损模型实验，用以评估仿生皮肤的体内治疗效果。手术过程示意图如Figure6所示，在背部表面创建一个缺损，然后将3D打印的仿生皮肤植入缺损处。为了将仿生皮肤牢固固定在缺损处，在所有缝隙处注入GelMA/HA-NB/LAP水凝胶，通过UV光交联的GelMA/HA-NB/LAP水凝胶也可作为生物胶。对照组大鼠出现抓挠行为，而仿生皮肤植入组和正常组大鼠未出现防御反应(无抓挠反应)。因此，这些结果表明，植入的仿生皮肤，成功地在机体表面起到了类似于自然皮肤的保护屏障作用。并且在炎症反应实验中，仿生皮肤与其他组相比，几乎没有或几乎没有炎症迹象。表明仿生皮肤在不激活先天炎症反应的情况下，能够提供理想的伤口愈合环境。在血管化实验中，它也能够加速伤口愈合过程中的新血管形成，并促进皮肤附件的真皮再生。

图6 仿生皮肤用于大鼠全层皮肤缺损修复

而临床相关大型动物模型的实验中表明，与对照组相比，仿生皮肤组的伤口愈合速度明显更快，如Figure7。H&E染色还显示，仅在仿生皮肤组有皮脂腺和毛囊形成，而对照组几乎没有形成皮脂腺和毛囊。此外，仿生皮肤组的再生皮肤结构与天然皮肤的健康结构非常相似(包括毛囊，血管，皮脂腺)。从TEM图像可以看出，与正常组相似，与对照组相比，仿生皮肤组的胶原纤维排列整齐紧密。

图7 仿生皮肤用于猪全层皮肤缺损修复

本研究表明，利用基于投影式光固化的3D打印技术结合仿生生物墨水和功能细胞制作仿生皮肤具有良好的可行性。仿生皮肤中相互连接的微通道有利于充分的营养交换，在促进细胞和新形成组织之间的相互作用中发挥了重要作用。且仿生水凝胶生物墨水所提供的微环境能最大限度地促进细胞迁移和增殖。体内研究表明，无论在小型动物还是大型动物中，仿生皮肤都能促进皮肤的伤口愈合，在皮肤附属物(如毛囊)的再生方面也表现出了优越的性能。

总之，基于投影式光固化的3D打印、仿生水凝胶生物墨水和功能细胞的独特结合，为快速、大量生产生物活性器官提供了有效途径，可以创造出更多的定制化和功能化的活体器官，并应用于组织工程研究。

论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2020.120287