Science Advances：3D生物打印双因子释放的梯度结构支架促进各向异性软骨再生

来源：EngineeringForLife

软骨损伤是一种常见的导致关节功能障碍的疾病，但由于软骨细胞较少且无血管，其自愈能力有限。现有的治疗措施不能改善关节内组织，往往由于感染或无菌性松动而最终导致治疗失败。因此，寻找一种修复软骨组织的方法成为了治疗软骨损伤的研究方向。近期，来自上海交通大学附属第九人民医院戴尅戎院士团队在Science Advances上发表了题为"3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration" 的文章，设计了一种具备良好生物相容性及力学性能的梯度结构支架，用于软骨修复。

首先，研究人员用PCL分别打印了梯度支架及非梯度支架的支撑结构。其中，非梯度支架的纤维间距为150μm（提供生物力学刺激）或750μm（提供生物化学刺激），而梯度支架的纤维间距由表面150μm到深层750μm逐渐变化。同时，研究人员将骨形态发生蛋白4（BMP4）和转化生长因子β3（TGFβ3）分别包裹到PLGA微球中，并将PLGA微球和骨髓间充质干细胞（BMSCs）包裹到水凝胶中，注射到PCL纤维间隙之间。为了更好模拟全层软骨结构，最深层为包裹BMP4的水凝胶，而上层为包裹TGFβ3的水凝胶（图1）。

图1 支架的设计及制备工艺

接着，研究人员观察了支架的宏观结构及微观结构，并对支架的生物相容性及、细胞分布情况及细胞分化情况进行表征，证实了每一层的水凝胶-PCL复合结构具有良好的连通性和精细有序的结构，支架具有良好的生物相容性，并且浅层的细胞为软骨细胞表型，而深层的细胞为肥大软骨细胞表型（图2），证实了PCL支撑结构对细胞的分布、营养供应及增殖分化提供了适宜的环境。研究人员还证实细胞在水凝胶中形成了相互作用的网格状结构，并且可以沿PCL纤维分布、增殖（图3），表明支架的水凝胶组分在打印过程中保持了细胞活力，并为骨髓基质干细胞的增殖、扩散和浓缩提供了有利的微环境，以在体外分化为软骨细胞。

图2 PCL支架的性质与功能

图3 支架水凝胶组分的性质及功能

随后，研究人员通过TGFβ3和BMP4分别诱导BMSCs的分化，证实TGFβ3可以诱导BMSCs分化成为透明软骨样细胞，而BMP4可以诱导BMSCs表达肥大软骨样细胞相关蛋白。同时，研究人员将梯度支架与非梯度支架分别在体外培养12周，结果显示非梯度支架约1/4-1/3形成软骨样组织，而梯度支架全层均形成软骨样组织，其杨氏模量与正常软骨组织接近，且这些组织的蛋白表达均与正常软骨组织类似，组织染色结果也呈现出类似结果（图4）。这些结果证实梯度支架可以诱导BMSCs形成软骨样组织，且具备软骨组织的力学性能。

图4 双因子释放诱导梯度结构支架中软骨基质的形成

研究人员进一步将梯度支架植入兔膝关节软骨缺损处，通过对组织大体外观、组织染色及相关组织学评分进行分析，证实了支架的软骨修复作用（图5），支架的浅层主要表现为软骨样细胞，而深层骨化标记物表达显著增加，证实了支架较大孔隙可以更好促进微血管长入及营养供应，诱导深层组织向成骨细胞方向分化（图6）。

图5 梯度结构支架在兔膝关节软骨缺损体内模型中显示出较好的各向异性软骨修复效果

图6 梯度结构支架恢复了天然软骨的各向异性，促进微血管向深层生长

综上，研究团队设计了一种具有梯度结构、双重分泌诱导因子的软骨修复支架，具有良好的生物相容性及力学性能，在体外及体内均具备形成软骨样组织的能力，为软骨损伤的修复提供了新的思路。

参考文献

YE SUN, YONGQING YOU, WENBO JIANG, BO WANG, QIANG WU, KERONG DAI . 3D bioprinting dual-factor releasing and gradient-structured constructs ready to implant for anisotropic cartilage regeneration. SCIENCE ADVANCES 09 SEP 2020 : EAAY1422. DOI: 10.1126/sciadv.aay1422