诱导自然骨生成，用于3D打印的促成骨互穿网络生物墨水

来源：EngineeringForLife

生物打印是一种新兴的增材制造方法，用于制备再生医学的3D结构。然而，开发具有高打印性、结构稳定性、生物降解性和生物活性特性的细胞相容生物墨水仍然是将3D生物打印技术转化为临床前和临床模型的主要挑战。

来自Texas A&M University的Akhilesh K. Gaharwar团队开发了一种纳米工程离子-共价纠缠(NICE)的互穿网络生物墨水配方，用于3D骨生物打印。通过一系列实验证实了NICE生物墨水在制造患者特异性、可植入的3D支架用于修复颅颌面骨缺损的能力。该生物墨水有望推动3D打印再生医学的发展。相关论文“NanoengineeredOsteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue”发表在ACS Applied Materials ＆ Interfaces杂志上。

NICE生物墨水有三个主要成分：共价交联的甲基丙烯酰明胶(GelMA)，离子交联的卡帕卡拉胶(kCA)，和静电带电的纳米硅酸盐(nSi)。GelMA提供了一种类似细胞外基质(ECM)的环境。kCA是从海提取的多糖，可以通藻中过钾离子进行离子交联(图1A)。GelMA和kCA的结合形成了离子共价纠缠网络(图1A)。这种结合极大地提高了水凝胶的机械强度和韧性。

为了评估生物墨水的可打印性，研究者选择了一个能够打印的高长宽比结构，从而找到一系列可打印的成分(图1B-C)。结果表明，如果没有足够的kCA,GelMA和nSi打印效果不好，因为它们在热凝胶前会流动(图1D)。kCA提供临界粘度和屈服应力，在挤压层冷却并通过热凝胶固化时，将其固定在适当位置。

图1 NICE生物墨水设计和打印性能评估

接下来研究者设计了峰保持流变性试验来模拟3D打印过程中的生物墨水环境。交联的3D打印水凝胶能够维持剪切、弯曲和拉伸等机械变形，没有明显的永久变形，并能迅速恢复其原始形状(图2B)。将支架交联并植入下颌骨的热塑性模型中发现，NICE生物墨水能够迅速将表面粘在一起，抵抗剪切和分层力（图2 D）。根据这些结果，最终选择7.5% GelMA、2%nSi和1%kCA作为优化的生物墨水进行进一步测试。

图2 NICE生物墨水的流变性和3D打印结构的力学性能

3D生物打印支架最初是透明的，但培养60天后，支架变得不透明(图3A)。力学测试显示，3D打印支架在PBS和培养基的作用下，其压缩模量和韧性在14天内保持不变，但在第21天出现显著损失(图3B)。支架在60天内保持了结构的完整性，并保留了超过80%的初始质量(图3C)。扫描电镜成像显示，从第14天开始微观结构密度增加(图3D)。这表明，发生了大量的细胞介导的重塑，其广度足以将3D打印支架的宏观结构结合在一起。

图3 NICE支架支持细胞诱导的基质重塑

然后研究者使用组织学方法评估了几个月以来由hMSCs对NICE生物打印支架的重塑，显示软骨形成的软骨内骨化样重塑过程，随后矿化，类似于自然骨形成。结果表明，NICE生物墨水即使在没有成骨诱导因子的情况下也能诱导成骨分化和组织重塑。此外，在这几个月的培养和重塑过程中，支架保持其整体形状和完整性，这表明支架的生物降解与细胞重塑是同步的。（图 4）

图4 3D生物打印支架的ECM重塑

研究者用Von Kossa和茜素红染色来区分类骨质和实际钙化骨(图5A)。正如预期的那样，VonKossa和茜素红在早期的时间点上都没有显著的钙或磷酸盐存在，但几周后，可以看到显著的钙和磷酸盐沉积。使用钙-甲酚酞络合酮测定法定量检测钙含量并且通过EDS显示钙含量的变化(图5B-D)。结果显示，支架内最初并没有钙的存在，培养60天后，由于hMSCs成骨分化，钙和磷酸盐含量增加。

图5 3D生物打印支架的矿化基质

为了证实软骨内成骨，研究者使用RNA全转录组测序来表征hMSCs中的基因表达。通过对暴露于nSi的hMSCs的全转录组测序，可以确定软骨内骨形成的基因表达增加。值得注意的是，BMP和TGF信号同时存在，它们的SMAD信号通路表达增加，表明NICE能诱导骨髓间充质干细胞软骨内分化。（图 6）

图6 nSi对hMSC基因表达的影响

综上所述，这种NICE生物墨水具有3D生物打印骨组织的多种理想特性，包括高打印性能、酶降解性和骨诱导性。这项研究的最终目标是为患者打印特定的骨支架来精确匹配他们的损伤。这种技术将作为一种可定制的、易于操作的自体骨移植替代方案，为外科医生提供更多的骨手术选择。

参考阅读：

David Chimene, Logan Miller, Lauren M.Cross, Manish K. Jaiswal, Irtisha Singh, and Akhilesh K. Gaharwar.Nanoengineered Osteoinductive Bioink for 3D Bioprinting Bone Tissue. ACSApplied Materials & Interfaces.

https://doi.org/10.1021/acsami.9b19037