AHM：用于3D打印的硫醇/降冰片烯功能化明胶水凝胶

来源：EngineeringForLife

光固化明胶基水凝胶由于其优异的生物相容性、生物降解性、光响应性、热敏性和生物打印性能，已成为组织工程中常用的生物墨水。来自Karlsruhe Institute of Technology的Ute Schepers团队提出了一种降冰片烯功能化明胶(GelNB)的水基合成方法，其与巯基化明胶(GelS)混合，通过点击化学反应产生超快光固化凝胶GelNB/GelS。这种水凝胶在未来的医疗应用和生物制造技术中很有使用前景。相关论文“Tuning Superfast Curing Thiol-Norbornene-Functionalized Gelatin Hydrogels for 3D Bioprinting”发表于Advanced Healthcare Materials杂志上。

研究者开发了一种新的GelNB的合成方法（图1A），首先，降冰片烯（NBCA）在pH为5-6的MES缓冲液中溶解，经EDC·HCl和NHS活化转化为琥珀酰亚胺酯。羧酸、EDC·HCl和NHS的摩尔比为1:2:1。加入明胶后，将pH提高到7.5~ 7.8，引起明胶伯胺与琥珀酰亚胺酯的反应，从而制得GelNB。而GelS的制备反应、净化和储存在惰性气体气氛下进行，以防止二硫键的形成。然后采用TNBSA分析对DoF进行量化(图1B-C)，发现GelNB的DoF高达97%。GelS的DoF尽管与GelNB相比较低，但也在正常范围内。

图1 GelNB和GelS前驱体合成原理图

接下来研究者对三种不同交联密度的GelNB/GelS水凝胶的性能进行测试。结果发现，水凝胶的溶胀能力随着交联程度的增加而降低，这是由于聚合物网络结构更紧密、更不灵活。同时，降解结果表明，低交联度的GelNB/GelS降解速度更快，可在7天内完全降解。这是因为交联密度决定了酶对水凝胶网络内部结构的扩散能力，因此低交联水凝胶的分解速度加快。并且光引发剂浓度的降低对GelNB/GelS水凝胶的固化时间影响不大。而GelNB/DTT水凝胶的固化时间相对较长，且随着LAP用量的减少而增加。（图2）

图2 GelNB/GelS的性能

接着，研究者研究了未交联的GelNB和GelS与GelMA的生物相容性，并评估了它们的前驱体的毒性。结果发现GelNB和GelS前驱体在几个小时内表现出类似的生物相容性，而GelMA的细胞活力仅在2h后就显著下降。对于3D生物打印来说，在数分钟到数小时的合理时间内，细胞在未交联的前驱体溶液中保持高水平的活性是很重要的，因此，基于硫代烯的生物墨水是更有利的3D打印材料。(图3)

图3 GelNB/GelS的生物相容性

将正常人真皮成纤维细胞(NHDF)被包埋在GelNB/GelS水凝胶中培养14天，以研究细胞的粘附、扩散、活力和增殖行为。结果发现，细胞在低交联水凝胶中细胞扩散和增殖速度要快得多。除了不同的交联速率，研究者还研究了GelNB/GelS水凝胶中NHDF的生物学性能，并与GelNB/DTT和GelMA进行比较(图4C，D)。培养7天后，三种水凝胶中成纤维细胞均呈纺锤形，细胞活力无显著差异。尽管这三种水凝胶对3D细胞培养都非常适合，但3D生物打印中，生物墨水的制备和光交联通常会根据层的大小延迟几分钟。因此，必须考虑甲基丙烯酸酯基团的副反应以及交联剂和光引发剂的毒性对于细胞的影响。

图4 GelNB/GelS的细胞3D培养

通过对不同交联度的GelNB/GelS水凝胶的流变行为进行了测定发现，GelNB/GelS的G '随着聚合物网络中交联密度的增加而增加。测量光交联前三种前驱体溶液在14℃下的存储模量，确定了氨基功能化对温度诱导的可逆凝胶过程的影响(图5B)。与交联GelNB/GelS水凝胶趋势相反。G'随交联密度的增加而降低。这是因为降冰片烯基团具有疏水特性和空间位阻，它通过阻止明胶链在低温下自组装成三螺旋来扰乱物理凝胶作用。此外，研究者还测定了未交联GelNB/GelS溶液的剪切粘度分布，以评估其对基于挤压的3D生物打印的适用性(图5C)。在37℃时，GelNB/GelS前驱体溶液具有很强的类液性，表现出近似牛顿力学行为，粘度对剪切速率没有明显的依赖关系。

图5 GelNB/GelS的流变学行为

最后，使用含NHDF的水凝胶前驱液进行3D打印，以评价GelNB/ GelS与GelMA的生物墨水性能。结果发现，巯基生物墨水提高了细胞存活率，并且交联度越高，细胞存活率越低，而且GelNB/GelS的细胞活性明显优于GelMA，并且细胞形态良好。

图6 GelNB/GelS的3D打印

综上所述，本研究开发了一种新型的水基合成路线，制备了用于3D生物打印的超快固化GelNB/GelS水凝胶。该水凝胶具有优越的生物相容性，出色的3D生物打印性能，并且成本低，在组织工程和光基生物制造技术中有着巨大的使用前景。

参考文献

Tobias Göckler, Sonja Haase, Xenia Kempter, Rebecca Pfister, Bruna R. Maciel, Alisa Grimm, Tamara Molitor, Norbert Willenbacher, Ute Schepers. Tuning Superfast Curing Thiol-Norbornene-Functionalized Gelatin Hydrogels for 3D Bioprinting. Advanced Healthcare Materials.
https://doi.org/10.1002/adhm.202100206