来源：生物打印再生工程
作者：吴炳炎
在过去的几十年里，心脏组织工程领域取得了进步。然而，大多数研究进展仅限于具有简单拓扑结构的微尺度工程化心肌组织 (ECT)，如3D条带和心肌补片。尽管微尺度ECT有利于药物筛选应用，但它们在心脏修复和心脏疾病体外建模方面的应用十分有限。最近，研究人员进行了各种尝试来构建工程化心肌腔室 (ECP)，例如腔室，以重现天然心脏的结构复杂性。从微尺度ECT到宏观ECP的转变将大大加速其应用；然而，研究人员面临着拓扑结构重建、血管化和功能成熟等障碍。
近日，清华大学机械工程系的熊卓和张婷教授课题组（BRE团队）在Biomaterials发表了一篇名为“Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: a review”的综述文章，总结了生物工程方法制造功能性工程化心肌腔室的最新进展。文章回顾了制造ECP的生物工程方法，总结了目前在微尺度和中观尺度上设计血管系统的方法，介绍了使心脏组织功能成熟的各种策略，并对未来提出了展望。
背景介绍
在全球范围内，心血管疾病是人类死亡的主要原因，其患病率也在随着人口老龄化而增加。当向心脏供血的动脉被阻塞时，心肌梗死与缺血性损伤有关，瘢痕组织中的纤维状胶原蛋白和成纤维细胞取代死亡的心肌细胞(CM)，永久性降低泵血能力，最终导致心力衰竭。成人心脏是人体再生率最少的器官之一，心肌细胞每年的周转率约为0.3-1%。迄今为止，心脏移植仍然是治疗晚期心力衰竭的金标准，而供体器官长期短缺和免疫排斥一直是巨大的挑战。因此，需要寻找治疗缺血性心脏病的替代策略。
干细胞疗法是一种很有前景的治疗方法。在过去15年中，许多临床实践取得了进展，但仍有一些问题需要解决，包括肿瘤发生风险、移植物免疫排斥和移植物细胞死亡等。此外，这种方法的长期治疗效果存在争议，因为目前的分娩途径，包括冠状动脉注射、静脉注射和心肌注射，导致细胞保留率/移植率低(<1%)和存活率低。在过去十年中，研究人员开始认识到干细胞疗法主要通过旁分泌机制来发挥作用。因此，使用非编码RNA包括微RNA(miRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和外泌体等方法吸引了越来越多的兴趣。此外，研究人员最近报道，使用特定的转录因子组合，能够将心肌梗死后的瘢伤组织直接重编程到心肌细胞中，并在体内和体外都得到了验证。然而，尽管存在可行性且前景诱人，但应该指出，这些概念仍处于起步阶段，需要在临床应用前对安全性和有效性进行系统验证。
此外，心脏组织工程也是一种治疗方法。心脏组织工程的重点是在体外创造有功能的心脏组织替代物来替代或恢复受损的心肌。除心脏修复外，工程化心肌组织还可用于药物筛选和体外心脏功能和疾病建模。在过去的几十年里，心脏组织工程领域有两个截然不同的方向。一个方向是在微尺度上发展具有最小结构复杂性的功能性工程心肌组织(ECT)，如3D条带和心肌补片。微尺度ECT的厚度通常小于500 μm，不需要引入血管系统来满足其代谢需求。相对较小的体积有利于其存活和体外成熟，此外，微尺度ECT能够产生力并对药物做出可预测反应。由于ECT拓扑结构重建简单，且具有高通量和标准化的特点，其可应用于药物筛选。
另一个方向是在宏观尺度上开发工程化心肌腔室(ECP)，包括工程人类心室和完整的心脏模型。目前，在啮齿类动物实验中有治疗效果的心脏心肌补片需要扩大，以满足人类移植物的要求。更重要的是，单纯扩大心脏心肌补片可能不足以完全恢复受损心脏的功能。对于先天性心脏病，如左心室发育不良综合征，工程心室可能是一个更好的移植选择。而对于终末期心力衰竭，在未来可能需要一个工程全心来代替捐赠的心脏。与微尺度ECT相比，宏观ECP可作为研究心功能和疾病的更理想模型。ECP可以评估压力-容积指标，并具有人类心脏的功能，因此有望最终取代动物模型。
在过去的几年里，许多研究人员对制造ECP进行了各种尝试。2018年，Parker的团队通过在椭圆形电纺丝支架上播种细胞，开发了一个类似心室的腔室。然而，由于固有的低细胞播种效率(通常小于107个细胞/cm3)，工程心室的壁厚被限制在100 μm左右，导致收缩强度小得多，仅相当于其原生心室的2%左右。3D生物打印技术，特别是新型的嵌入式挤出生物打印技术，已成为制造工程化心肌腔室更理想的方法。2019年，Dvir的团队通过在悬浮介质中打印载有细胞的脱细胞胞外基质生物墨水，生成了一个全尺寸的心脏模型。但由于体外培养时间不够长，该模型未能实现大尺度收缩功能。最近，基于悬浮水凝胶的自由形式可逆嵌入 (FRESH) 技术，Feinberg团队产生了接近生理细胞密度(约3×108个细胞/cm3)和同步搏动能力的开放心室，以及一个无细胞全尺寸人类心脏模型。同样，Ogle的团队在悬浮介质中通过3D打印产生封闭的心室，其细胞密度接近于人诱导多能干细胞的原位增殖和分化所获得的生理细胞密度(约3×108个细胞/cm3)。然而，由于缺乏血管，这些研究中工程脑室的壁厚限制在200μm左右。到目前为止，大尺度ECP的发展仍处于起步阶段，ECP内单个心肌细胞的成熟度仍然不足。
从微尺度ECT到宏观ECP，以及最终完整的心脏移植物的实现与几个关键挑战有关，包括拓扑结构重建、血管化和功能成熟(图1)。本文的目的是回顾这些领域的最新技术进展，并为功能性ECP的进一步实现提供思路。在文章中，首先介绍了重构天然心脏的复杂拓扑结构重建特征的生物工程方法，并强调接近生理的细胞密度的作用，这对其生理功能至关重要。对于厚心脏组织和ECP来说，多尺度血管的整合是维持细胞活力所必需的。因此，本文也讨论了心脏组织的血管化策略及其在宏观ECP中的潜在适用性。此外，本文回顾了目前工程化心肌组织的成熟机制，强调了它们促进单个心肌细胞成熟的能力以及它们在宏观ECP中的适用性。最后，本文针对相关挑战、趋势机遇，提出了一系列重要观点。
图1 体外构建工程化心肌腔室(ECP)的主要挑战
工程化心肌腔室(ECP)的制造
在过去的几十年里，出现了多种制造技术来设计制造工程化心肌组织和工程化心肌腔室。这些技术通常分为两类，即自上而下的策略和自下而上的策略。不同的制造技术重现天然心脏的结构复杂性和细胞密度的能力存在差异(图2)。自上而下的策略包括支架接种和水凝胶浇铸的方法。尽管支架接种方法具有构建复杂结构的能力，但细胞接种密度较低(通常小于107/cm3)。水凝胶注模策略能够实现高细胞密度，但只能形成较为简单的拓扑结构重建。基于载细胞微单元模块化组装的自下而上策略包括自组装、远程组装和定向组装方法。其中，3D生物打印通过逐层精确定位细胞和生物材料，已成为最有前景的工程化心肌腔室构建方法。展望未来，工程化全心脏的最终实现方案可能在于细胞自组装和3D生物打印技术的融合。
图2 体外构建心肌组织的生物工程策略。自上而下的策略包括支架接种(a)和水凝胶注模(c)；自下而上策略包括自组装、远程组装和定向组装(b)。 图3 工程化心肌腔室(ECP)制造方法。通过在旋转椭圆形收集器上拉纺纤维制成纳米纤维心室形支架，接种多能干细胞分化的心肌细胞并用导管传感器缝合在管道上，在施加外部压力的生物反应器中培养(a)；在灌注生物反应器中将完整大鼠心脏再细胞化(b)；在定制的模具中铸造类器官并依次从模具中取出，构建的人类心室样心腔(c)；通过喷墨打印构建半心脏模型(d)；在支撑槽内打印带有三脚架血管和分离的左右心室的心脏模型(e)；通过FRESH技术打印的接近生理细胞密度的开放心室(f)。
工程化心肌腔室(ECP)的血管化
天然心脏是高度血管化的器官。分级血管系统向单个心肌细胞输送必需的营养和氧气，并通过旁分泌信号促进心肌成熟和整体收缩功能。对于厚心脏组织的再生，促进营养交换的体外动态培养只能在有限的扩散距离下维持细胞活力，而宿主血管系统生长进入工程组织的血管生成过程通常需要数天到数周时间，无法提供及时的营养供应。因此，在移植时加入血管网络，并促进其与宿主血管系统的整合对于确保厚心脏组织的细胞活力和功能成熟至关重要，ECP也是如此。
人类心脏中的分层血管系统包括动脉、小动脉、静脉、小静脉和毛细血管，直径跨越几个数量级。除内皮内层和基底膜外层外，微尺度毛细血管还稀疏地被周皮细胞覆盖，而中尺度小动脉和大尺度动脉则被平滑肌细胞以及弹性蛋白和胶原纤维结合。毛细血管在大约200 μm的距离内为实质细胞提供有效的营养和氧气交换，而肌肉动脉和小动脉控制着血液的搏动流动(图4a)。到目前为止，研究人员在工程组织中微血管和中尺度血管的形成方面分别取得了很大进展(图4b-f)。内皮细胞可在载细胞基质中自组装形成微尺度毛细血管，然而它们往往难以在体外灌注并在体内与宿主血管相吻合。生物工程方法可生成数百微米至数毫米的中尺度血管，并与宿主血管结合，然而它们不能有效地将营养物质输送到周围组织。因此，大尺度ECP的长期生存需要在体外形成微、中尺度血管，模拟复杂的多尺度血管。
图4 克服扩散限制的血管化策略。微尺度毛细血管(b-d)和中尺度血管(e-f)的体外形成是厚心脏组织所必需的；微尺度毛细血管的体外形成依赖于内皮细胞(EC)的自组装，其由血管新生和血管形成驱动(b)；微血管取向由拓扑结构重建或力学信号调节(c)；通过吸引周皮细胞和提供合适的力学环境促进微血管成熟(d)；单层血管的形成是通过在血管细胞存在时产生预先标记的通道或在EC播种后形成的(e)；通过同轴打印和扩散诱导凝胶化方法形成多层异质血管(图f)。
图5 工程化心肌组织中微尺度、中尺度血管构建方法。内皮细胞(EC)能够自组装成微毛细血管结构，由内皮细胞特异性PECAM-A(绿色)和DAPI(蓝色)染色(a)；EC在VEGF梯度(红色箭头)下萌发成胶原支架，并用罗丹明-鬼笔环肽(黄色)和DAPI(蓝色)染色。白色和无色箭头分别表示与茎细胞相连和分离的尖端细胞(b)；机械约束条件下纤维蛋白凝胶中微毛细管取向，内皮细胞由红色 hCD31标记，转导周皮细胞由绿色荧光蛋白(GFP)标记，细胞核由蓝色Hoescht标记(c)；与GelMA水凝胶中的血管周围细胞共培养促进微毛细血管的成熟和稳定。其中内皮细胞由DsRed标记，表达αSMA的平滑肌细胞从间充质干细胞分化而来(d)；通过逐层组装具有预先设计拓扑结构重建形状的胶原水凝胶，形成可灌注血管通道。内皮细胞用CD31(红色)和DAPI(蓝色)染色(e)；在3D打印的易流变性Pluronic F127模板上浇铸载细胞水凝胶形成可灌注血管通道，通道内有HUVEC(红色)衬里，周围组织包裹有人类新生儿真皮成纤维细胞(HNDFs，绿色)(f)；使用载有EC的牺牲生物墨水3D打印微纤维，通过牺牲打印的方法制造血管化心脏心肌补片，用CD31(绿色)和肌动蛋白(粉红色)染色(g)；通过牺牲打印策略形成血管通道，并用HUVECs(绿色)灌注(h)；用DMD立体光刻法直接制造血管化组织，HUVEC(红色)封装在通道中，HepG2细胞(绿色)封装在周围组织中(i)；利用光切除的方法在荧光素修饰的水凝胶(绿色)中生成仿生血管通道，并用荧光微珠(红色)灌注(j)；通过同轴打印策略形成双层血管(图k)。 工程化心肌腔室(ECP)的成熟
一方面，虽然微智造技术特别是3D打印技术能够精确控制细胞和生物材料的空间沉积，以创建腔室的拓扑结构重建形状，但工程化心肌腔室不能自动获得天然心脏的功能。工程组织通常需要经过数周或数月的体外培养，通过细胞黏附、组织和基质沉积等方式完成组织形态形成和成熟。另一方面，多能干细胞的出现，包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)，为体外产生心肌细胞(CM)提供了有效的细胞来源，并且具有临床规模的高通量和高纯度。然而，干细胞分化的心肌细胞(PSC-CM)通常是不成熟的，其结构和功能特征类似于胎儿心肌细胞(约第十六周)，细胞和组织水平上的不成熟性已经极大地阻碍了其在心肌再生中的应用。例如，PSC-CM衍生的心脏心肌补片由于其独立的、异质性的收缩活动可能改变宿主心肌的电传播，从而导致致命的心律失常风险。迄今为止，通过模拟心脏发育过程中的体内环境，已经开发出多种策略来促进心脏工程组织的功能成熟(图6)。本文回顾了目前工程化心肌组织的成熟策略，并强调了它们在工程化心肌腔室成熟中的潜在作用。虽然目前大多数成熟策略都是通过二维培养模型、微尺度的类器官或心脏构建物来证明的，但这些成熟策略与血管化策略相结合，有潜力在更大尺度上应用于工程化心肌腔室的成熟。
图6 模拟体内环境的体外成熟策略。在胎儿早期，胚胎心脏长成新月体，之后形成由心肌层和心内膜层组成的心管，两者之间有果冻状的细胞外基质。在胎儿晚期，心管通过折叠和旋转成环，并在冠状血管系统和传导系统开始发育的同时转变为腔室心脏。代谢改变、细胞外基质和非肌细胞相互作用以及机械和电刺激协同作用，促进CM从未成熟胎儿期向完全成熟成人期发育(a)；hiPSC心源性分化能够得到成熟程度与早期胎儿CM相当hiPSC-CM。目前已建立了一套促进心脏工程组织体外成熟的生物工程方法，包括长期培养、生化诱导、与非肌细胞共培养、细胞-基质相互作用和生物物理刺激等(b)。
展望与总结
在过去的几年里，具有复杂拓扑结构重建特性的宏观ECP的制备策略和微尺度ECT的成熟策略取得了显著的进展。随着干细胞、生物材料和3D生物打印等技术的快速发展和融合交叉，功能性工程化心肌腔室的体外制造取得了长足的进步，人类有望迎来完整的人工心脏。本篇综述讨论了功能性工程化心肌腔室的一些主要挑战和重要瓶颈，如与制造、血管化和成熟相关的问题。解决这些挑战可以在很大程度上推进心脏修复和心脏疾病的体外建模的技术水平。除了这些瓶颈，其他关键的挑战包括PSC-CM的成本效益和宏观扩展、工程心肌与宿主心肌的电整合、宿主机体的免疫排斥、低温保存和监管障碍等，需要在未来的临床转化中加以解决。
参考文献
本文第一作者为清华大学机械系生物制造中心的博士后方永聪，通讯作者为清华大学机械系生物制造中心的熊卓副教授、张婷副研究员。
Fang Y, Sun W, Zhang T, Xiong Z. Recent advances on bioengineering approaches for fabrication of functional engineered cardiac pumps: A review. Biomaterials 2022;280:121298.
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2021.121298
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