助力3D生物打印：基于脱细胞基质生物墨水的3D打印真皮研发新成果 ——皮肤创伤患者...

助力3D生物打印：基于脱细胞基质生物墨水的3D打印真皮研发新成果——皮肤创伤患者的希望

背景介绍

烧伤作为第四大最常见的皮肤创伤诱因，除休克和败血症外，皮肤创伤处继续生长和收缩的瘢痕也是烧伤最严重的并发症之一，它不仅会损害患者的外貌，还会严重影响患者的生理及心理健康。防止瘢痕收缩最先进手段包括早期移植或皮瓣转移。然而，此类治疗可能会导致供体或皮瓣部位瘢痕挛缩，并且常常受到皮肤/皮瓣来源不足等因素制约。因此，临床实施困难重重。虽然已有部分研究报道结合3D打印及生物墨水制备皮肤类似物用于皮肤创伤修复并已取得很好的实验结果，但目前的研究大多集中在体外材料介导的细胞反应， 而非宏观的伤口愈合过程， 且该类生物材料在抑制瘢痕挛缩方面的作用目前尚无足够的证据和结论进行支撑， 因此探索新型真皮材料的研发及复合生物3D打印技术将为提高患者皮肤创面修复质量带来新的希望。

近日，一篇名为“3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization”关于皮肤表面创伤修复的文章由中山大学附属第一医院烧伤外科祁少海教授研究团队和中山大学材料科学与工程学院陈永明教授团队共同在生物医学1区及生物材料1区期刊Bioactive Materials发表。

该研究团队从具备多年临床应用经验的猪真皮细胞外基质材料入手， 制备了可以高效保留猪真皮层细胞外基质主要成分的的生物活性粉末， 并利用此粉末制备了可供生物3D打印的温敏墨水。该团队使用此墨水， 通过挤出式3D打印方式， 制备出了具有百微米级别空间构型的皮肤真皮结构类似物（PDA）。 实验结果表明该3D打印制备的真皮类似物具有良好的生物相容性， 可有效促进植皮后的早期血管化， 更有意义的是能够通过调节皮肤再生相关基因的表达从而有效抑制植皮创面挛缩而带来的瘢痕影响。

实验结果

1.        猪真皮细胞外基质超细粉末（dECM）的制备与表征

首先，通过DAPI、Massons染色和甲苯胺蓝染色等实验方法证明可通过机械破碎方式获得具有组织特异性的超微细胞外基质粉末和影响局部细胞行为的功能性分子， 如糖胺聚糖（GAGs）等。

2.        利用3D打印技术制备体外皮肤类似物（PDA）

通过流变学测试优化并确定了包括打印温度（18-20°C），墨水浓度（8.5wt%），打印速率（50mm/min）在内的打印参数，利用3D打印方式制备体外皮肤类似物（PDA）。3D打印构建的类皮肤结构经戊二醛交联后进行了体外降解及细胞毒性实验。实验结果表明，经化学交联的PDA在体外降解56天时依然保持良好的结构完整性。通过在PDA表面接种L929成纤维细胞，通过细胞活/死染色和MTT检测均证明此PDA具有良好的生物相容性。

3.        体内实验-皮肤伤口移植收缩评估

使用大鼠全皮层创伤模型评价PDA对分层厚皮移植（STSG）中伤口愈合及收缩的评估。实验结果证明PDA在减少疤痕收缩和促进伤口愈合效果方面优于作为阳性对照 （PL）的售类真皮产品Pelnac®。

4.        皮肤移植物术后变化及基因分析

通过不同时间点采集的皮肤移处切片经组织染色表征，发现PDA可有效减轻伤口纤维化，并在促进胶原沉积成熟的同时对受损毛囊、皮脂腺等附属器官也有一定的修复。与此同时，通过对代谢和信号通路基因追踪发现并确定了PL组和PDA组动物创伤表型的差异是由材料介导的创伤细胞在遗传水平上的一系列变化引起的。

5.        皮肤移植血管新生分析

研究发现，在皮肤植入早期，功能性的新血管产生与移植皮肤类似物的正常机理维持有关，新血管的形成可以防止瘢痕形成和相关部委皮肤收缩。本实验中，通过镜下观察移植物周边微血管密度和相关基因数据判断移植物植入术后的存活情况。在术后，PDA组微血管数呈现先增加后减缓的趋势，与此同时，诱导新血管生成，且能促进肝纤维化的Grem1基因检测显示PL组中参与新血管形成的相关信号通路相关基因呈上调趋势，与组织学结果一致。

6.        手术部位巨噬细胞极化

皮肤受伤后会引起一系列的炎症反应，在所有参与这一反应的免疫细胞中，mϕ表型(M1趋向M2)的转化不仅是伤口修复调节的关键条件，也是材料-新生组织整合及瘢痕形成的关键因素。通过免疫组化CD68、CRR7、CD163对各区段的巨噬细胞m ϕ表型进行免疫染色评价。实验结果表明，自第14天起，PDA移植创面中M2比例明显高于IS和PL移植创面，表明的伤口有助于为再上皮化和从肉芽组织发育为特征的修复阶段向稳定阶段过渡。

结论

本文报道了一种新颖的用猪真皮脱细胞基质3D打印组装PDA移植物的抗瘢痕方法，移植PDA可以显著减少创面收缩和瘢痕形成， 同时PDA植入组表现出高效的早期血管重建，巨噬细胞向M2表型的极化增强，皮肤功能保存较好的修复效应，其修复结果与正常皮肤形态学相似。本研究通过分子生物学进一步阐述了移植物在皮肤创伤修复、瘢痕形成上的基因调控机理， 同时未来生物材料对皮肤抗瘢痕特性的改善及其临床可译性奠定了一定基础。

Chen L, Li Z, Zheng Y, Zhou F, Zhao J, Zhai Q, et al. 3D-printed dermis-specific extracellular matrix mitigates scar contraction via inducing early angiogenesis and macrophage M2 polarization. Bioactive Materials 2022;10:236-46.

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.09.008