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刺激响应性生物材料是生物3D打印的重要原材料，能为结构成形、细胞生长以及组织成熟提供适宜的物理化学以及生物学特性。近日，来自清华大学、美国Drexel University和上普的生物3D打印研究者合作，在Materials Today （影响因子=31.04）上发表了题为“Responsive biomaterials for 3D bioprinting: a review”的综述文章。 背景和简介 该综述重点关注了近年来基于刺激响应生物材料的生物墨水在挤出式生物3D打印应用的重要进展。刺激响应生物材料的物理化学性质会在外界物理刺激（如光照，温度，机械应力，电磁场）,化学刺激（如pH值， 金属离子），和生物学刺激（如酶，代谢产物，细胞牵引力）等环境作用下产生可控的变化。相应的材料响应包括物理/化学交联，键裂，流变性质变化，形态变化等。挤出式生物打印对生物墨水的剪切稀化、快速和可控胶凝和生物响应性有特殊的要求，因而刺激响应生物材料在墨水设计、打印结构快速成型和打印体生物活性等方面都有巨大的应用潜力。本文总结了生物3D打印领域常用的刺激响应生物材料，并从可打印性、结构成型、细胞存活率和打印体生物活性的角度探讨了多功能响应生物材料的应用策略。同时给出了生物墨水的主要制备标准和策略，包括单组分墨水，多组分墨水，动态墨水，纳米复合墨水。随后本文进一步讨论了刺激响应性生物材料在生物3D打印的一些潜在应用，包括悬浮支撑打印、生物4D打印和打印药物释放载体。最后，本文从刺激响应生物材料研发制备和生物打印技术创新的角度，给出了未来创新性多功能生物墨水设计的发展方向。 图1 刺激响应生物材料在生物3D打印中的应用 刺激响应生物材料总体分类 刺激响应生物材料按照材料来源和组分可以分类为：天然多聚物，合成多聚物和复合多聚物。天然多聚物获取途径包括动物，植物，藻类，微生物的发酵，以及酶促反应。根据化学结构，天然多聚物主要分为多糖，蛋白质和多聚核苷酸。由于其极高的生物相容性，天然多聚物在生物医药领域有广泛的应用。合成聚合物可以通过光、热引发的一种或者多种单体的均聚物反应和共聚物反应聚合而形成。生物打印中常见的合成聚合物包括聚乙二醇（PEG），泊洛沙姆，聚异丙基丙烯酰胺（PNIPAAm），聚乙烯醇（PVA），聚氨酯等等。合成的聚合物水凝胶通常具有明确的化学结构、分子量和亲水性，能够精确控制它们的物理化学性质。复合多聚物是指结合了天然聚合物，合成聚合或者带有无机物或生物活性分子的高分子材料，用以实现对环境刺激的特定或多重响应。复合生物材料的主要优点是能够结合不同的特性并克服单组分造成的限制。 Table 1. Representative responsive biomaterials for 3D bioprinting
刺激响应生物材料在可打印性方面的重要性 具有良好可打印性的生物墨水可以顺畅地通过打印喷嘴，形成具有高度形状保持能力的连续细丝，并能具有高度的结构完整性。评估生物墨水的可打印性主要方法包括定性描述、定量测量以及模拟仿真（图2）。影响生物墨水可打印性的因素是多方面的，包括材料特性（如粘度，剪切稀化，成胶速率，表面张力），以及打印条件（如挤出压强，打印速率，喷嘴尺寸，温度控制）。由于刺激响应生物材料在外界刺激条件下具有可控的物理化学变化，因而在调控生物墨水可打印性上有重要的作用。表2列举了通过刺激响应生物材料的特性调控生物墨水可打印性的一般策略。生物墨水在挤出之后应当被立即交联以保持结构的完整性和稳定性。由于刺激响应生物材料在剪切力，超声波，光照，温控，pH值，离子，等条件变化下能产生交联，因此在生物打印过程中调控刺激条件是调控生物墨水可打印性的重要一环（图3）。 图2 可打印性的定量和定性测定
表 2. 调控生物墨水可打印性的策略
图3 基于刺激响应生物材料的生物膜水交联机理和在生物打印的应用策略 刺激响应生物材料在生物相容性方面的重要性 在生物打印中，实现良好的可打印性和高细胞存活性一直是一项持久的挑战，因为一些有利于可打印性的因素会对细胞存活率产生负面影响。例如高粘度对生物打印体的结构完整性和稳定性方面有很大助益，但是挤出高粘度的生物墨水所产生的高剪切力会导致细胞损伤，固缩或核溶解。一些影响细胞的存活率的因素包括：生物墨水的材料特性（如流变性，粘度），打印参数（如打印速率，交联时间，温度），以及细胞的种类等。因此，调节生物墨水组分，优化打印参数以维系高细胞存活率（大于90%）成为了生物打印应用中一项关键的步骤。 因为生物活性材料可以与细胞相互作用并引发特定的细胞反应（如增值，分化，迁移），所以生物墨水的生物活性对于细胞培养和生物打印组织结构的成熟至关重要。总体上，用于增强生物活性的策略包括：混合天然聚合物和生化因子（如生长因子、细胞因子和蛋白质），化学结合生物活性基序（如肽序列，生长因子）和脱细胞细胞外基质（dECM） 生物墨水的使用。 图4 打印过程中细胞损伤机制和存活率 生物墨水制备策略概述 基于刺激响应生物材料配制生物墨水遵循一系列生物墨水设计标准，包括可打印性，生物相容性，生物活性和机械性能。利用刺激响生物材料设计墨水在总体上一共有四种策略：单组分墨水，多组分墨水，动态墨水，纳米复合墨水。单组分生物墨水依赖于具有适当流变和仿生特性的单组分生物材料。与多组分墨水复杂的成分和多响应机制相比，单组分生物墨水具有更简单的可控性和打印过程，在某些情况下，这可能是生物打印的更好选择。而多组分墨水在墨水设计中结合了多个刺激响应组分，可以整合不同生物墨水成分的优势。动态墨水的典型代表是制备可以自组装形成超分子网络的生物墨水，这些生物墨水中的成分会形成非共价键和/或超分子结构，一般具有显著的的剪切稀化特性。纳米复合生物墨水包含纳米级成分，例如纳米纤维、纳米管、纳米颗粒和其他纳米材料。已有研究证明，在墨水中添加纳米材料可产生出色的剪切稀化特性、细胞响应性和机械性能，适用于挤出式 3D 生物打印。 前沿和观点 3D 生物打印已经从打印生物相容性材料发展到打印用于组织再生和个性化医疗的基于活细胞和类器官的生物墨水。它是一种用于制造具有仿生复杂性的生物模型的前沿技术。 在过去的十年中，对结构复杂、高分辨率和生物相容性的生物打印的需求导致人们在探索创新的生物墨水和生物打印策略方面付出了巨大的努力。 具有剪切稀化或触变特性的生物材料还被用作悬浮打印的支撑介质，从而用于传统生物打印无法打印的材料和结构。Lee 等人提出了一种悬浮水凝胶的打印策略（FRESH）来制造人体心脏组件。FRESH 是通过将胶原蛋白打印到由热响应明胶微粒浆液制成的支撑浴中进行的。挤出的胶原蛋白在支撑介质的 pH 驱动交联后，在 37 °C 条件下明胶支撑介质可以被顺利移除（图4A）。 4D 生物从 3D 打印演变而来并将时间作为第四维度引入。通过打印刺激响应生物材料获得的 4D 打印仿生结构会响应外部或内部刺激而发生形状转变。 4D 生物打印技术能够制造复杂的组织结构和对形状转换进行按需动态控制。Kirillova等人开发了一种4D生物打印自折叠管状结构的方法。由于在交联时打印体不同高度的材料光的吸收率不同，而产生交联梯度，2D结构在浸入水溶液后因膨胀系数的差异从而折叠形成管状结构（图4B）。 因为刺激响应生物材料具有与生物环境交流的固有能力，所以它们可用作药物的运输载体。这些“智能”生物材料可以通过溶胀/收缩、断裂键、表面变化和结构变化等机制响应生物和病理信号。 运输系统的受控药物释放是通过自我调节或通过外部或内部刺激直接/渐进激活来实现的。Bozuyuk 等人打印了由甲基丙烯酰胺壳聚糖和超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）制成的微型游泳装置（图5C）。使用双光子直接激光写入将墨水制成双螺旋几何形状。在旋转磁场存在时的，微型游泳者可以以 3.34 ± 0.71 μm·s-1 的速度移动。 化学治疗性阿霉素用叠氮化物被修饰并整合到光裂解分子的炔烃端。在用 365 nm 紫外光照射后，连接分子被切割然后药物得意释放（图4C）。 在打印过程中可打印性与细胞存活率之间存在的不相容性仍有待解决。打印具有天然组织的复杂性、机械性能和分辨率的打印体仍然是一项重大挑战。我们相信未来的研究和开发有两条路径可以指导生物打印技术的进步。第一个是基于现有的打印技术，将新型刺激响应性生物材料设计和制备成合适的生物墨水。具体而言，生物墨水的开发应侧重于配方、交联机制、细胞相容性和生物活性。基于研究成熟的水凝胶体系制备复合生物墨水可能是生物墨水开发的便捷策略。同时，使用新型化学合成手段制备多功能响应性水凝胶系统始终是开发用于 3D 生物打印的新型生物墨水的一种选择。考虑到天然生物组织形成的动态过程，我们设想具有动态粘弹性的响应材料在 3D 生物打印中具有应用前景。另一条路径是利用生物材料的刺激响应特性开发创新性生物打印技术和策略。此外，应建立相关的可打印性评估方法，以实现生物打印结果的标准化。考虑到在生物打印相关参数和物理模型之间建立有效联系具有相当的难度，机器学习是一种强大有效的工具，可以通过多种方式优化打印过程来改善生物打印结果，例如调整构造结构、调控可打印性和检测结构缺陷。总体而言，我们设想响应生物或病理信号的生物材料在精准医学、药物输送、再生医学和组织工程应用中具有巨大潜力。 图5 刺激响应生物材料在悬浮打印，生物3D打印和打印药物释放载体上的应用 上普博源（北京）生物有限公司作为一家集生物3D打印设备、生物墨水研发、服务、生产、销售于一体的先进团队。公司提供上普BioMaker系列生物3D打印装备及与其配套的系列生物墨水， 可为细胞3D打印， 响应性生物材料打印及组织工程和体外软组织模型构建的重要工具。 另外，上普博源还新推出了一款多喷头低温沉积打印机——SUNPALPHA-BP31，该设备可胜任多种高分子材料、骨粉、金属粒子、凝胶类材料的打印， 是一款具备构建多种孔隙尺度及复杂结构骨及硬组织工程支架的3D打印设备。
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