来源：分析人
细胞中的痕量元素分析对于研究细胞信号传导、生理病理学和疾病的早期诊断至关重要。电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）是痕量元素分析的有力工具之一，具有高灵敏度和多元素/同位素同时检测的优点。然而，将ICP-MS直接用于细胞中的痕量元素分析时，通常会面临细胞消耗量较大（通常为104-106个细胞）、基质干扰和细胞内目标元素含量低于仪器检出限等问题。在引入ICP-MS之前，采用微型化的样品前处理手段，可以在一定程度上去除复杂基质、富集胞内目标元素。微流控芯片具有多功能集成、适合微量样品处理的特点，在芯片上集成样品引入单元和前处理模块可以大大提高分析效率。
近期，武汉大学胡斌教授课题组报道了一种采用3D打印技术构建的集细胞裂解、整体柱微萃取、微阀控制单元和微流全耗型高效雾化器多功能一体化的微流控芯片，并将其用于细胞中痕量稀土的分析，相关成果以“3D Printed All-in-One Sample Introduction System for ICP-MS: Integrating Chip-Based Array Monolithic Microextraction, Microvalve Control, and Microflow Nebulizer”为题发表在国际化学权威杂志《Analytical Chemistry》上。
研究团队采用摩方精密面投影微立体光刻（PμSL）3D打印技术制造的一体化样品引入系统主要包含多功能阵列整体柱微萃取芯片和可拆卸微流全耗型高效雾化器（MTHEN）。该3D打印（3DP）阵列整体微萃取芯片由细胞裂解单元和阵列整体微萃取单元组成，并集成了微阀控制单元以实现上样/解吸的自动切换，通过具有定制结构和接口的3DP-MTHEN将其与ICP-MS在线连接。结合ICP-MS检测，系统评估了3DP整体柱对痕量稀土元素(REEs)的萃取性能以及3DP-MTHEN的雾化性能，并将其用于少量MCF-7细胞中痕量REEs的分析。
由摩方精密microArch® S130 （精度：2 μm）3D打印系统制备的3DP阵列整体柱微萃取芯片包括两个并联的微萃取单元，通过微阀控制单元集成在一起；每个微萃取单元设计了三个入口（图1A），分别用于将细胞溶液、裂解液和解吸溶液引入芯片。芯片入口设计为与商品化软管（外径1.5 mm）相匹配的长3 mm、内径1.5 mm、外径4 mm的管状结构，直接与商品化软管相契合。裂解单元由5个内径为150 μm、长轴为4 mm、短轴为1.5 mm的椭圆形通道组成（图1B），液体在椭圆中间裂分为两股，在流过半个椭圆通道后交汇，从而加快液体混合。微萃取单元的微观结构模拟金属有机框架UiO-66的骨架，其中拓扑重复单元的结构为：直径20 μm、底部方形边长80 μm，由这些拓扑重复单元组成了长度为1.2 cm、内部为0.75 mm × 0.75 mm × 12 mm的方形整体柱（图1C）。设计并构建了微阀控制单元实现流体控制：通过在溶液通道周围设计三个气体通道，气体流向垂直于液体流向，通过通/不通气体控制溶液的阻断和流通（图1D）。在一个3DP阵列整体柱微萃取芯片中，并行制造了两个微阀，分别用于控制废液和解吸液的流出。在出口单元中，将两路解吸液合并为一路与3DP-MTHEN相连，与后续ICP-MS检测实现在线联用（图1E）。
根据N,N-双（羧甲基）-L-赖氨酸（NTA）与REEs之间的强络合能力（logβ1=10-12.5），将其用于3DP整体柱骨架的表面氨羧官能团改性（图1F）。目标REEs在未改性3DP整体柱上的吸附效率小于50%。随着改性次数的增加，目标REEs的吸附效率逐渐增加。经过4次改性后，3DP整体柱对REEs的吸附效率达到95%以上（图2）。
图1. 3D打印ICP-MS样品引入系统示意图。
图2. NTA改性次数对3DP芯片整体柱上REEs吸附效率的影响。
改性前后芯片整体柱横截面的表面形貌如图3所示：该3DP芯片整体柱结构均匀，与设计的模型结构一致。改性后的芯片整体柱上可以观察到明显的涂层结构，说明聚多巴胺介导的功能化涂层在芯片整体柱表面的成功制备。利用压汞法考察了NTA改性的3DP芯片整体柱的孔径分布（图3E）：该芯片整体柱的孔径主要分布在20-60 μm处，与模型设计的拓扑孔结构尺寸吻合良好。利用XPS对NTA改性前后的芯片整体柱表面进行表征，结果显示：改性后的芯片整体柱在402 eV处出现了新的特征峰，对应为NTA上叔胺的特征峰，说明芯片整体柱表面NTA的成功改性（图3F）。
图3. 3DP整体柱改性前(A,B)和改性后(C,D)的SEM图，孔隙分布(E)，以及NTA改性前后的XPS N 1s谱图(F)。
3DP-MTHEN的设计和实物照片分别如图4A和4B所示，MTHEN的长度及碗状接口的设计是为了匹配本研究所使用的ICP-MS仪器的炬管。为了在雾化过程中保持稳定，在圆柱形MTHEN中设计了一个中心有圆形通道的三棱柱结构。使用商品化毛细管作为MTHEN中用于液体引入的内管，通过将圆形通道的内径设计为内管的外径来固定内管的位置。将ICP载气均分为三路，分别从三棱柱与进样管空隙处引入，在MTHEN的尖端喷嘴处形成高压，将内管引入的液体雾化成气溶胶。
图4. 3DP-MTHEN的设计图(A)和实物照片(B)，以及载气流速(C)和样品流速(D)对信号强度和精密度的影响。
以Li、Co、In和U为代表元素，以灵敏度和稳定性为评价指标，优化了影响3DP-MTHEN分析性能的诸多因素。在0.96-1.12 L min-1的流速范围内，随着载气流速的增大，Li、In、Co和U的信号强度均呈现先增大后减小的趋势。当流速低于1.10 L min-1 时，其信号强度的相对标准偏差（RSD）没有明显变化；随着载气流速继续增大，其RSD逐渐增大。在本研究中，选择载气流速为1.04 L min-1，此时信号灵敏度最高，稳定性较好（RSD<10%）。在1-8 μL min-1的范围内，考察了样品流速对Li、Co、In和U的信号强度和稳定性的影响，随着样品流速的增大，四种元素的信号强度逐渐增大；当流速大于6 μL min-1时，其信号强度达到平台；当流速达到8 μL min-1时，在炬管壁上观察到雾滴，说明此时雾化器产生的气溶胶粒径较大，未被全部引入ICP中。在1-7 μL min-1的流速范围内，RSD均小于10%，说明雾化效果较为稳定。在本研究中，选择样品流速为6 μL min-1。
利用喷雾激光粒度分布仪对距离雾化器喷嘴平面15 mm处的气溶胶粒径分布进行了考察，结果如图5所示。可以看出，3DP-MTHEN产生的气溶胶Sauter平均粒径D3,2（定义为气溶胶体积-表面积比）为5.4 μm，粒径小于8 μm的气溶胶个数占气溶胶总个数的82.0%。通过计算得到3DP-MTHEN的雾化效率和传输效率分别100%和81.1%，传输效率与雾化器产生的粒径小于8 μm的气溶胶个数占气溶胶总个数的百分比（82.0%）吻合良好。
图5. 3DP-MTHEN产生的气溶胶粒径分布(A)和不同粒径气溶胶的体积分数(B)。
图6为用于ICP-MS的3DP一体化样品引入系统的照片，其中3DP阵列整体柱微萃取芯片通过3DP-MTHEN与ICP-MS在线联用，用于MCF-7细胞中超痕量REEs的测定。所建立的分析方法操作简单，细胞消耗量少（500个细胞），方法的精密度和检出限分别为2.2-11.9%和1.3-8.6 ng L-1，可实现细胞基质中超痕量REEs的定量。
图6. 3DP一体化ICP-MS样品引入系统。
总结：
本研究通过3DP技术构建了由阵列整体柱微萃取芯片、微阀和微流雾化器组成的多功能一体化样品引入系统，将其与ICP-MS在线联用，用于细胞中超痕量REEs的分析。多功能阵列整体柱微萃取芯片集成了细胞裂解单元、整体柱微萃取和微阀控制单元，具有结构简单、使用寿命长、死体积小、成本低、易于与ICP-MS检测相匹配等优点。将高度集成的3DP一体化样品引入系统作为ICP-MS的样品引入单元，基于此所构建的在线分析方法细胞消耗量低，适用于分析小体积复杂样品，为后续REEs的细胞毒性研究提供了有力的技术支持。
原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.4c05810
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