洞察组织生物打印最前沿！Cell重磅评述

来源： EngineeringForLife


工程化生物人工组织通常由细胞、生物材料和生物分子构成，在医学上有着广泛应用。 这些组织不仅可以用于了解疾病的形成和进展，还可以用于开发生物替代品来修复或替换受损器官。此外，实验室培养的组织也可用于开发人源化体外模型，以验证药物的安全性和有效性。生物打印结合了增材制造和组织工程来生成功能性组织和器官。

2022年7月21日发表在《Cell》上的一篇评述文章对组织生物打印的研究现状做了总结和进一步的展望，相关内容以“Tissue bioprinting for biology and medicine”为题，作者是来自加州大学洛杉矶分校（UCLA）的Ali Khademhosseini教授和加拿大维多利亚大学的Mohsen Akbari教授。该评述重点介绍了生物打印领域的最新突破，并讨论了在该技术广泛应用于生物学和医学之前尚未解决的挑战。

随着新支架制造技术（如生物打印、程序化自组装）的出现、具有细胞调节能力的新型生物材料的爆发、新型细胞来源的开发（例如，诱导多能干细胞）、用于疾病建模和药物筛选的器官芯片系统的引入以及基因编辑工具（例如，CRISPR-Cas9）的出现（图1），组织工程领域在过去30年中取得了显着进展。

△组织工程的进展

组织工程在不同方面取得了进展。 迄今为止，可再生细胞来源、新型生物材料、能够在细胞水平上控制组织微环境的小型化系统、创新的生物制造方法和基因编辑工具可用于创建具有类似于天然组织的结构、组成和功能特性的组织模拟物。

尽管这些进步预示着医学的光明未来，但仍有许多障碍需要克服。首先，很难概括由不同长度尺度的多种不同细胞和材料组成的复杂活组织。第二个挑战是在组织制造和成形过程中保持细胞活力和功能。最后，大规模组织制造需要可扩展的方法，以便能够在体外快速制造仿生工程组织。

生物打印为在三维空间中沉积细胞和生物活性分子提供了极大的灵活性，并且实现了自动化工作流程，从而最大限度地减少了对细胞的手动操作，提高了组织制造的可扩展性以便进行高通量药物筛选。

△生物打印的进步增强了组织拟态和细胞活力

这些进步带来了几项技术创新，包括FRESH打印、多材料挤压和基于光的打印、体积生物打印，以及具有改进细胞相容性的新型颗粒生物墨水。

1. 增强组织拟态
每种组织都有其独特的结构（包括不同细胞类型和成分的排布等），以实现特定的功能。例如，心脏是由同步收缩的对齐纤维状结构构成以实现泵血功能，而肝脏由六边形结构和大量的、缠绕在一起的血管网络组成，负责过滤血液供应中的有毒物质并释放胆汁以帮助消化食物。在几纳米到几厘米的长度范围内模拟复杂结构的能力对于最终的工程组织的功能实现至关重要。

为了实现功能性组织的制备，几种创新的生物打印策略被开发出来。美国卡内基梅隆大学Feinberg教授团队提出了一种利用悬浮水凝胶自由可逆嵌入（FRESH）来对胶原蛋白进行3D生物打印的方法，能够在不同的尺度上直接获得具有精确控制组成和微观结构的人心脏组织成分，从毛细血管到整个器官，相关论文发表在《Science》上（EFL也分享解读了这项开创性的工作，详见文末“链接1”）。尽管FRESH打印取得的成果令人振奋，但这个过程仍然很慢，需要几个小时才能制作出厘米级的组织。这样使细胞暴露于次优的培养环境中，导致细胞受到很大的应力，进而可能损害其功能。此外，缓慢的打印过程限制了这项技术的临床转化。

生物打印技术需要快速沉积各种类型的细胞和材料，以重建复杂的结构。Mohsen Akbari教授团队采用多材料生物打印，同时或顺序分配不同的材料和细胞以实现组织仿生。然而，缓慢的沉积速度和在打印头之间切换所需的时间会显着降低生物打印速度，同时将细胞长时间保持在非生理环境中将影响打印后的细胞功能。Ali Khademhosseini教授团队使用一束毛细管构成的打印头，通过数字控制含有不同生物墨水的打印头之间的快速平滑切换和协同工作，制备了复杂的组织结构，提升了多材料生物打印的速度。长期以来，使用基于光的技术，例如数字光处理 (DLP)，进行多材料生物打印一直是一项重大的技术挑战。在打印过程中更换生物墨水既费时又费力，并且会损坏结构和细胞。为了解决这个问题，Ali Khademhosseini教授团队开发出一种多材料DLP生物打印机，利用计算机控制的微流体生物墨水注射装置将不同的生物墨水快速流动到图案光的路径上，同时实现自动化生物墨水更换和清洗步骤，将打印速度提高了5倍。

2. 增强细胞活力
在具有临床尺寸（厘米级）的组织中保持细胞活力和功能面临着许多挑战，包括大量的处理时间、施加于细胞的高剪切应力以及需要血管输送氧气与营养同时去除细胞废物。

加利福尼亚大学伯克利分校Hayden K. Taylor团队开发出高速“容积3D打印技术”，只要光照几十秒，完美雕像浮出水面。相关论文发表在《Science》上（EFL也分享解读了这项开创性的工作，详见文末“链接1”）。受计算机断层扫描原理的启发，乌得勒支大学Riccardo Levato教授团队使用体积打印在20秒内将载有类器官的明胶水凝胶塑造成复杂的厘米级 3D 结构（EFL也分享解读了这项开创性的工作，详见文末“链接2”）。到目前为止，体积生物打印技术还处于起步阶段，这种方法需要大量的生物墨水和大量的细胞来打印大型组织。此外，当前的体积打印机仅限于打印一种生物墨水，这限制了其在模拟天然组织的多组分复杂性方面的应用。

打印方法和条件对细胞活力有很大影响。例如，基于挤压的打印细胞在通过窄管时会受到很高的剪切应力。细胞受到的剪切应力与生物墨水粘度和打印速度成正比，与喷嘴直径成反比。因此，任何提高打印速度和分辨率的努力都可能使细胞受到高剪切应力并降低细胞活力。反之，降低生物墨水粘度可以提高细胞活力，但会阻碍可打印性并导致支架机械性能不佳。为了解决此问题，Mohsen Akbari教授团队使用同轴打印的方法，使细胞远离剪切应力最高的通道壁，从而保护细胞免受粘性生物墨水带来的流变剪切力。另一种策略是使用光学生物打印。因为这种方法不使用喷嘴进行打印，所以细胞不会受到破坏性的剪切力。

生物墨水的物理和化学特性对打印后细胞的活力和功能也至关重要。现有生物墨水的一个普遍缺点是孔径小，这会阻碍可溶性分子的对流转运并阻碍细胞迁移和组织重塑。Griffin 等人使用颗粒材料制备支架用于皮肤组织快速再生，该生物墨水具有大表面体积比和短扩散路径的优点，增强了向细胞的营养输送以及废物的去除，促进了细胞的长期存活。此外，这些生物墨水的互连孔隙在支架降解之前促进细胞向内生长和组织重塑。Fang 等人使用具有不同尺寸和特性的微凝胶，制造出与天然组织结构相似的极其复杂的组织结构。事实上，颗粒状生物墨水的广泛应用需要它们能够模拟天然组织的各向异性和分层结构。为此，具有非球形几何形状的微凝胶和 Janus 微粒可用于制造颗粒状生物墨水。这可以与计算流体动力学和人工智能相结合，以最大限度地提高质量传递和细胞向内生长，同时保持生物打印组织的机械性能。

构建功能性组织的障碍之一是确保工程结构在制造后的长期生存。大自然通过形成一个多尺度的血管网络完美地规避了这一挑战，这些血管网络在整个组织中相互交织。美国莱斯大学Jordan S. Miller与华盛顿大学Kelly R. Stevens合作，利用投影立体光刻（projection stereolithography）3D打印技术，制备出会“呼吸”的人工肺，只需数分钟就可在透明光聚合水凝胶中制备具有3D内部功能结构的血管系统，相关论文发表在《Science》上，并被选为当期封面。（EFL也分享解读了这项开创性的工作，详见文末“链接1”）。尽管基于光的方法相对较慢，但可以一次生成多个组织——这一特征对于药物筛选的高通量组织生产至关重要。

3. 展望
在过去的几年里，生物打印在各个方面都取得了长足的进步。进一步提高生物打印分辨率，同时允许制造具有厘米级尺寸的临床相关组织，是下一个重要的里程碑。然而，实现高分辨率需要较长的打印时间，并且会在打印过程中将细胞暴露在高剪切应力下，所有这些都可能会损坏细胞并损害打印后的细胞功能。因此，未来的努力应该集中在使生物打印组织在生理环境中保持高细胞活力的创新上。此外，使用数值模拟工具和机器学习方法对生物打印参数和生物墨水的生物物理和生化特性进行系统评估可以提高分辨率和组织模拟，同时保持细胞活力并最大限度地降低操作成本。

用于器官移植和再生医学的具有临床相关尺寸的生物打印组织需要数十亿到数万亿个细胞，由此带来了大批量细胞培养的挑战。传统的平面培养系统无法大规模生产细胞。填充床培养系统和悬浮平台可用于满足生物打印大型组织的批量要求。然而，与扩增和分化培养基的高成本、污染以及用于大规模生产细胞的现有分化方案的优化相关的挑战仍然存在。因此，生物反应器设计的进步和新型微载体的开发能够实现高产量的高密度细胞培养，这将极大地有利于组织打印领域。

用于器官移植的生物打印组织需要经过严格的监管程序，以确保其长期安全性和有效性。由于生物打印应用的多样性，受到 FDA不同部门的监管，因此为建立生物打印产品的质量标准制定通用指南可能具有挑战性。与器官移植相比，用于疾病建模的生物打印面临的监管障碍更少。然而，生物打印疾病模型仍需要验证，以确保正确模拟结果临床转化所需的病理生理学和药代动力学特性（例如炎症反应、代谢、分子转运）、稳健性和可重复性。

总体而言，生物打印技术的不断更迭和广泛应用，将极大地影响个性化医疗的发展。生物打印的未来应用也不局限于器官移植和疾病建模，还可以用于创建含有藻类或细菌的结构以生产可再生能源或捕获二氧化碳，或者通过生产“人造肉”彻底改变食品行业。

文章来源：https://www.sciencedirect.com/sc ... i/S0092867422007206