山二医/上海交大周广东团队：生物3D打印助力半月板重建

来源：EFL生物3D打印与生物制造

半月板是半月形纤维软骨组织结构，具有减震和稳定膝关节生理功能。临床上半月板损伤常见于运动医学，严重者需进行同种异体移植或假体移植半月板重建手术。当前，基于“钢筋-混凝土”理念的生物3D打印策略可以提供理想的组织工程半月板移植物，有望实现半月板置换再生修复。但是，临床上半月板切除术中，韧带断裂、关节磨损加剧等引发炎症反应与氧化应激的恶劣微环境，严重阻碍半月板软骨再生。因此，急需创新组织工程构建策略，以协同调控软骨免疫微环境，才能更好地实现半月板软骨再生。

近期，山东第二医科大学整形外科研究所、山东省组织再生修复与重建重点实验室（筹）王迪副教授，联合上海交通大学医学院附属第九人民医院周广东教授、华宇杰副研究员在《ACS Nano》期刊上发表论文“Core-Shell Codelivery Nanocarrier Synergistically Regulates Cartilaginous Immune Microenvironment for Total Meniscus Replacement”，本研究开发了一种 "核-壳 "式共递送纳米给药体系，可协同调控软骨免疫微环境，成功应用于全半月板置换术。如图1所示，介孔二氧化硅纳米颗粒内核封装一种抗氧化和抗炎中药单体药物——大黄素，同时在外壳上通过可逆二硫键修饰一种纤维软骨分化因子GDF，成功构建共递送纳米给药体系（Em@MSN-GDF）。随后，基于“钢筋-混凝土”理念的生物3D打印构建力学增强型半月板替代物，成功实现兔模型纤维软骨再生与半月板重建。

图1. 新型 "核-壳 "共递送纳米给药体系（Em@MSN-GDF）协同调控软骨免疫微环境用于全半月板置换的示意图。

1.Em@MSN-GDF 制备和表征
本研究开发了一种“核-壳”式共递送纳米载体Em@MSN-GDF，持续释放大黄素和GDF，以调控半月板切除术后氧化应激与炎症反应等恶劣微环境，并促进纤维软骨再生。如图2所示，大黄素封装于介孔二氧化硅微球内核；GDF通过二硫键可逆接枝于外壳。实验结果表明，介孔硅球形形态均匀，直径约170 nm；核磁共振和XPS光谱验证了介孔硅接枝改性和药物负载的可行性。纳米载体显示出~14%的大黄素包封率和12.5%的GDF接枝率。45天持续释放实验表明，大黄素释放了约60%；GDF释放了约50%，证明该系统具有长期免疫调节和促进纤维软骨再生的潜力。

图2. Em@MSN-GDF 纳米载体制备和表征

2.Em@MSN-GDF/GC水凝胶表征
随后，研究者将Em@MSN-GDF纳米颗粒引入GelMA/CSMA（GC）软骨特异性基质水凝胶，构建Em@MSN-GDF/GC复合水凝胶材料。如图3所示，水凝胶能够快速光交联成形，具有良好的稳定性、微孔结构和机械性能，纳米颗粒的加入未显著影响其理化特性。细胞实验表明，水凝胶对成纤维细胞与软骨细胞具有良好的生物相容性，并促进细胞铺展和增殖。

图 3. GC 和 Em@MSN-GDF/GC 水凝胶的制备和理化特性表征。

3.体外抗氧化和抗炎功能评价

为了改善软骨免疫微环境，本研究将具有抗氧化与抗炎作用的大黄素封装于介孔二氧化硅纳米颗粒中（Em@MSN-GDF）。H₂O₂诱导实验显示，Em@MSN和Em@MSN-GDF可显著降低细胞活性氧ROS水平，并下调GPX1与NQO1表达，证明其抗氧化效果。LPS诱导下，两组处理均促进巨噬细胞向M2表型极化，抑制促炎症因子TNF-α表达，促进抗炎因子IL-4表达（图 4）。研究结果表明，Em@MSN与Em@MSN-GDF可通过释放大黄素发挥抗氧化抗炎作用，改善术后炎症微环境，有助于半月板软骨再生。

图 4. Em@MSN和 Em@MSN-GDF 的体外抗氧化和抗炎作用

4.纤维软骨分化功能评价
本研究采用体外Transwell模型研究发现，软骨细胞（CHs）分泌物可促进纤维细胞（FBs）成软骨分化。进一步研究表明，GDF能够显著提升纤维细胞中软骨相关基因（COL II、ACAN、α-SMA、SOX9）表达，并促进其向纤维软骨分化。进一步通过不同FBs/CHs比例的皮下植入实验发现，FBs7/CHs3组的软骨再生效果最佳，其与FBs3/CHs7组在COL II表达无统计学差异，但α-SMA表达更高，显示出更优的纤维软骨表型特征（图5）。

图 5. GDF 对体外和体内纤维软骨再生功能评价

5.评估 Em@MSN-GDF 在体内软骨再生中的作用
为了提高软骨再生稳定性和机械强度，研究者利用生物3D打印技术打印出矩形 PCL 支架，并注入了含有 FBs7/CHs3 细胞的GC水凝胶，分为GC-PCL组、Em@MSN/GC-PCL组和Em@MSN-GDF/GC-PCL组。如图6所示，Em@MSN-GDF/GC-PCL表现出更高的杨氏模量和压缩应变，COL II和α-SMA表达水平也显著提高，说明GDF的持续释放有效增强软骨样组织形成，同时Em@MSN-GDF/GC-PC组显示出更好的机械性能、细胞相容性和软骨诱导功能。

图 6. Em@MSN-GDF/GC-PCL 体内软骨再生评价

6.半月板置换和修复效果评估
为验证半月板再生的可行性，本研究在新西兰兔中进行半月板切除和置换术，利用3D生物打印技术构建含PCL支架、7:3比例FBs/CHs和Em@MSN-GDF/GC水凝胶的复合结构，并植入缺损区域。术后6、12周MRI显示组织重建良好。组织学表明Em@MSN-GDF/GC-PCL组在形态、细胞表型及基质沉积方面更接近正常半月板。免疫荧光检测显示α-SMA、VEGF和VWF表达显著升高，血管分布亦更符合生理特征。且ICRS评分显示软骨损伤明显改善。结果表明，该系统可显著促进半月板再生，有望成为一种临床可替代的半月板重建治疗方案（图 7）。

图 7. 半月板置换和修复的体内评估

本论文是由山东第二医科大学与上海市第九人民医院联合培养研究生王雅杰完成。此外，该工作还得到了国家重点研发计划（2024YFA1107800）、国家自然科学基金、中国博士后科学基金等项目，以及上海市组织工程重点实验室平台支持。

文章来源：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsnano.4c16158.