Materials today advances|利用SUNP BP11低温沉积3D打印构建促血管化骨再生的多机...

骨组织工程已经发展多年，但骨支架仍存在一些缺陷导致其未能进入临床使用，主要包括难以与周围组织整合，生物活性差。已有多项研究发现，在组织工程支架中构建药物递送体系可以实现多种功能，有望解决这些缺陷。近日，一篇名为“3D-printed scaffold with halloysite nanotubes laden as a sequential drug delivery system regulates vascularized bone tissue healing”的文章由清华大学的孙伟教授研究团队在Materials today advances (IF=7.579)上发表。该研究展示了一种低温沉积制造的复合不同机制药物控释支架，能够适配于体内先成血管再成骨的生理进程，在体内实验和体外实验中均取得了良好效果。

背景介绍

现已有部分载药支架致力于营造支架内部血管化环境增强骨诱导性并促进其与周围组织整合。但是取得效果不理想，原因有二：首先，如果支架只能单纯地将促血管化药物与促骨再生药物以相同方式加载并做长期释放，可能导致最后相比于只基于骨发生刺激的组别骨再生骨量更低，此外，一些依赖于核壳结构释放两种药物的水凝胶材料力学强度差易变形，且内部无多孔结构，修复中期可能相对于周围组织更类似于异物植入。

为了解决上述问题，该研究拟采用在支架中复合不同递送机制的方法。依赖于不同机制的药物释放在突释量-半衰期图表中占据不同的区域，也就意味着不同递送机制的平均释放时长有较大的差异。而在组织修复的过程，往往不是单一因子直接作用全程的过程，而是需要多个阶段相互协调，依次进行。所以这两者在时域上是可以良好匹配的，作用于修复前期的因子可以选择半衰期较短的递送系统，例如单纯扩散，静电相互作用等，而作用于修复后期的因子可以选择半衰期较长的递送体系，例如降解，侧链断裂等。

该研究中的支架针对于骨修复中血管生成和骨发生的生物学过程，其生理进程顺序为先成血管再成骨。选择埃洛石纳米管通过静电相互作用负载与释放促血管生成药物去铁胺（DFO），这一过程理论上会在较短时间内完成，避免长期释放带来的骨量下降的问题，选择壳聚糖微球包裹骨形态发生蛋白BMP2，通过材料降解释放，这一过程将适配于时间较长的整个骨修复阶段。研究路线如图所示，实验组将两种载药颗粒混合于骨支架基体材料PLGA-TCP体系中分散并通过不损害药物活性的SUNP BP11低温沉积3D打印机制成含多级孔隙结构，另外包括不含药物支架，只含促血管药物支架和只含促骨再生药物支架作为对比。最后通过体外和体内生物实验评估支架的促血管化能力和骨诱导性。

实验过程与结果

1. 载药支架理化性质表征

支架的总体结构如图所示，通过扫描电镜观察内部形态可以观察到两种载药颗粒且均匀的分布于支架内部。值得一提的是，纳米颗粒的加载可以大幅提高支架的压缩强度，使其与松质骨的平均压缩强度相近。同时可以发现支架具有较好的多级孔隙结构，宏观孔有利于组织更好的长入，而微观孔则满足了营养物质传送和药物从支架内释放的要求。释放动力学显示，实验组组支架可以匹配骨修复的不同阶段进程，在前期一周内可以促进血管生成，在较长时间内三周内可以持续释放BMP2促进骨组织再生。这与真实条件下的骨再生进程是相吻合的。

图2. (a)低温沉积打印支架的实物照片；(b)加载BMP2的壳聚糖微球；(b)加载DFO的纳米埃洛石；

(d)宏观尺度的支架形貌和(e)不同支架组中的微观结构；(f)不同组支架的抗压强度。

2. 体外实验-生物相容性验证

细胞活死染色和相对增殖率测试表面载药支架生物相容性好。且细胞骨架染色结果显示在含有促血管生成药物和促成骨药物的支架中，细胞伸展情况更为良好。

图3. (a)骨髓来源的间充质干细胞BMSCs的活/死染色；(b)第1天和第7天利用CCK8测定细胞增殖；

(c)第7天不同组别MSCs的细胞骨架染色。

3. 体外实验-验证间充质干细胞的成骨分化

骨钙素在调节骨钙代谢中起重要作用，是研究骨代谢的生化标志物。对骨钙素进行免疫荧光染色，载BMP2支架中细胞骨钙素表达水平更高，意味着更多的骨髓来源间充质干细胞在支架的调控下向着成骨的方向靠近。而加入内皮细胞的共培养发现在载DFO支架上生长更为良好，具体表现为内皮细胞间形成紧密的细胞连接且具有较大的覆盖面积并更好地形成紧密的粘附连接，。相关基因表达的测试与特征蛋白表达的结果互为印证。

图4. (a)MSCs 的骨钙素免疫荧光染色；(b)共培养实验中，MSCs 的骨钙素表达(红色)和HUVECs 的 CD31 (绿色) 的免疫荧光染色；

(c)BMSCs 在不同支架上接种后的碱性磷酸酶活性；(d)培养7天后成骨分化相关基因的mRNA表达，包括OCN、Runx2、Osterix、OPN、Col1a。

4. 体内实验-体内相容性分析

为了论证载药支架在体内培养条件下同样可以发挥功能，诱导血管生成并加速骨修复，该研究同时进行了大鼠皮下包埋异位成骨实验。可以看到载药支架与周围组织整合良好，周围组织完成了长入的行为，植入处的组织发生较为明显的血管生成，附着组织更为厚实。通过HE染色观察支架与周围组织的整合，可以看出，组织可以良好的长入到支架内部，在实验组中有大量类骨样组织的形成。利用免疫标志物的特征染色证明了递送体系的加入并不会引起额外的炎症反应。

图5. (a) 新组织-细胞结合物-实物照片；(b) 新生组织的苏木精-伊红 (HE) 染色；

(c) 不同组支架的CD206（M2 极化巨噬细胞标志物，绿色）和 INOS（M1 极化巨噬细胞标志物，红色）的免疫荧光染色图像

5. 体内实验-组织学分析

通过CD31免疫组化染色结果看出，在支架释放药物调控的作用下，血管数量和质量有明显提升。通过MASSON染色观察I型胶原生成量，更多的胶原生成和沉积表明两种药物的联合作用实现更好的促成骨效果。利用茜素红进行钙盐染色，可以发现在载药支架的调控作用下，支架内钙的生成和沉积更为明显且有更多的钙结节形成。

图6. (a) CD31 免疫组化染色显示血管生成情况；(b) Masson三色染色显示胶原数量；(c) 茜素红染色显示钙沉积和钙化结节形成

结论

针对于现有支架难以与骨修复多阶段生理进程兼容的现状，研究建立了复合静电相互作用和基质材料降解的多机制控释体系，并结合3D打印制造技术完成多种药物的功能性加载，成功构建了具有多级拓扑结构的仿生组织工程支架。该支架具有时序性递送功能，保证促成血管药物去铁胺168小时内完成快速释放，以及骨形态发生蛋白在超过600小时的较长时间段内持续给药，达到对体内骨修复过程中血肿、成骨等复杂多阶段进程所需生化环境条件的适配。大鼠体内实验结果显示，支架在3周内成功实现血管化骨组织替代物的诱导生成，相比未配备药物缓释体系的普通支架，获得 2倍以上新生血管数、3倍以上矿化胶原沉积量，有效促进骨修复的效率和质量。该种复合不同机制的时序递送系统有望应用于临床中大段骨缺损的治疗。

参考文献

J. Ji, C. Wang, Z. Xiong, Y. Pang, W. Sun, 3D-printed scaffold with halloysite nanotubes laden as a sequential drug delivery system regulates vascularized bone tissue healing, Mater. Today Adv. 15 (2022) 100259. https://doi.org/10.1016/j.mtadv.2022.100259.