受齿轮形状启发的3D 打印生物支架：用于免疫调节和骨再生

来源：EngineeringForLife  

免疫调节和成骨微环境对骨组织的三维再生具有重要意义。三维支架具有不同的化学成分、大孔结构和表面特征，为骨组织再生提供了有利的微环境。然而，生物陶瓷支架有序的表面微结构与骨再生的免疫微环境之间存在差距。在这项研究中，中国科学院大学上海硅酸盐研究所吴成铁课题组等通过一种改进的基于挤出的3D打印策略，成功地制备了具有良好表面微结构的齿轮启发的3D支架，用于免疫调节和骨再生。制备的齿轮支架可诱导巨噬细胞向M2表型极化以减轻炎症，进一步促进骨髓间充质干细胞成骨分化以形成新骨。在骨组织工程和再生医学的免疫调节和成骨微环境中发挥着关键作用。相关研究 “3D Printing of Gear-inspired Biomaterials: Immunomodulation and Bone Regeneration”于2022年9月12日发表在杂志《Acta Biomaterialia》上。  

研究表明，具有免疫调节特性的生物材料可以诱导巨噬细胞的适当反应，从而释放细胞因子，促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，最终促进新骨形成。因此，构建免疫调节性和成骨微环境对骨组织的三维再生具有重要意义。本文通过改进的3D打印技术成功地制备了具有良好表面微结构的齿轮状3D生物陶瓷支架，用于系统地调节骨组织工程领域中的免疫和成骨微环境。

1. 不同齿轮状结构的设计与制备
为了在生物陶瓷支架上构建齿轮启发的微结构，使用改进的基于挤压的3D打印技术的喷嘴设备，图1为齿轮状支架及其制造设备的示意图和实物图。

图1 改进型喷嘴和齿轮式支架的形态

2. 基于齿轮结构的生物陶瓷支架的三维打印与表征
为了探索齿轮状生物陶瓷支架表面微结构的生物学功能，制备了两个不同系列的结构变量(不同沟槽宽度或深度)的齿轮生物陶瓷支架(图2A)。以没有任何齿轮微结构的普通支架 (光滑) 作为对照材料 (图2A) 。为了进一步验证这种改进的3D打印技术的普适性，成功地制备了不同微观结构(图2B)、不同原材料 (图2C) 和内槽结构 (图2D) 的支架。由于β-磷酸三钙(β-TCP)具有良好的生物相容性、成骨性能和广泛的临床应用前景，本研究以其为主要基质材料。

图2 各种齿轮启发的支架的形态

3. 受齿轮启发支架的体外生物学评价
已经证明，微尺度的形态对细胞的行为和命运有影响。在此，研究了不同齿轮状生物陶瓷支架对RAW267.4细胞的免疫调节活性以及这些支架对RBMSCs的成骨活性。如激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)图像所示，齿轮生物陶瓷支架分别对RAW264.7细胞(图3A)和RBMSCs(图3B)表现出不同的作用。结果表明，盘状组件的沟槽宽度为20μm (G20) 时，支架对上述细胞具有最好的延伸性和定向效果。采用CCK-8法检测细胞在齿轮启发支架上的增殖活性。如图3C和D所示，所有支架都表现出较好的生物相容性，可以显著促进RAW264.7细胞的增殖，而RBMSCs的增殖活性略低于对照组。

图3 RAW264.7细胞和RBMSCs在不同齿轮状支架上的形态和增殖情况

为了探讨齿轮生物陶瓷支架的免疫调节特性和成骨特性，进行了实时聚合酶链式反应(RT-PCR)实验。将RAW264.7细胞负载于不同齿轮的生物陶瓷支架上，孵育2天。如图4A和图B所示，白细胞介素18(IL-18)的表达在G20组显著下调。诱导型一氧化氮合酶(INOS)在G20组表达下调，除促炎基因外，还检测到抗炎基因精氨酸酶-1(Arg-1) 的表达仅在G20组显著上调。白细胞介素1受体拮抗剂(IL-1ra)的表达在G20组明显上调。以上结果表明，G20的抗炎效果最好，且稳定。为了进一步研究齿轮生物陶瓷支架的成骨性能，将RBMSCs种植在不同的支架上，培养7d。成骨相关基因的表达如图4C和D所示。骨钙素(OCN)基因在G20组的表达明显高于对照组，表明具有相当的成骨活性。

除了RAW264.7细胞和RBMSCs的单一培养外，还建立了共培养体系，以探讨齿轮生物陶瓷支架的免疫调节作用。以G20支架为实验组，选择光滑支架为对照组。如图4E所示，将装有RAW264.7细胞的光滑支架或G20支架放置在Transwell小室中，同时将RBMSCs种植在平板上。共培养2天后，实验组RBMSCs OCN、骨桥蛋白(OPN)、Runt相关转录因子2 (RUNX2) 和BMP-2的基因表达水平显著高于对照组(图4F)，表明齿轮状生物陶瓷支架上的RBMSCs与RAW264.7共培养能有效促进成骨分化。

图4 齿轮状支架免疫调节性能和成骨性能的体外生物学评价

4. 受齿轮启发支架的体内生物学评价
为了进一步研究齿轮生物陶瓷支架的体内抗炎和成骨性能，建立了小鼠皮下植入模型和兔股骨骨缺损模型。选择空白、光滑和G20三组进行研究。如图5所示，空白组几乎没有炎症反应。此外，与光滑组相比，G20组齿轮式生物陶瓷支架能促进结缔组织和血管进入支架内腔。

图5 齿轮支架免疫调节特性的体内生物学评价

在建立小鼠皮下植入模型的基础上，建立兔股骨缺损区模型，研究齿轮激励生物陶瓷支架的体内成骨能力。手术8周后，所有的兔都被安乐死，并采集样本进行进一步的评估(图6A)。如图6B所示，相比于空白组，G20组支架(红色)内部有更多的新生骨(绿色)。Micro-CT统计分析显示，G20组的骨体积/总体积(BV/TV)值显著高于空白组和光滑组(图6C)。

图6 齿轮状支架成骨性能的体内生物学评价

此外，Van-Gieson染色显示G20组新生骨(红色)多于空白组和光滑组(图7)。VG染色切片中新生骨面积的定量分析也表明，G20组的成骨性能好于空白组和光滑组。

图7 新生骨的Van-Gieson染色(红色)

综上所述，通过基于挤压的3D打印策略，成功地制备了具有不同齿轮结构的生物陶瓷支架。3D打印策略在组织工程和再生医学的许多领域展示了多功能性和潜力。此外，齿轮状生物陶瓷支架在体外和体内都表现出良好的免疫调节和成骨活性。该研究提出了一种制造齿轮生物陶瓷支架的有前景的策略，将免疫和成骨微环境整合到三维有序微结构中，有望用于免疫调节和骨组织工程。

文章来源：
https://www.sciencedirect.com/sc ... 22005694?via%3Dihub